流式在微生物中的应用-细菌检测

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在国外,流式细胞术(Flow cytometry, FCM)已在细菌常规工作中得到广泛的应用[1],而在国内起步较晚。目前已经在实验室研究、工业生产、临床诊断、环境评估等领域的细菌快速检测有所应用。

FCM在实验室研究中的细菌检测应用

细菌研究中常需要是菌体计数,常规计数方法是平板法和显微技术,缺点是误差大和耗时长,且平板法只能计数活菌。FCM可以同时克服耗时长和误差大的缺点,快速得到细菌总数,若检测的是一定体积样品中的菌数,即得知菌浓度,并可区分活菌和死菌,获得活菌百分比。

FCM也可用于细菌鉴定。FCM检测的荧光强度与DNA片段大小成比例,Kim等[2]研究结果表明,FCM得到的DNA大小与脉冲场凝胶电泳(PFGE)结果具有高度一致性,而FCM所需纯化DNA样品量为pg级,且只需10min对数据进行处理和分析。可见,FCM有高度灵敏和快速的特点,是一种极具前景的细菌鉴定手段。

FCM在工业生产中的细菌检测应用

工业生产中,有时需要判断菌体活性,确保生产效率。运用FCM需选用膜非渗透性染料,如碘化丙锭(PI),不能进入具有完整细胞膜的活细胞,当细胞死亡或细胞膜不完整时,PI渗入细胞内嵌入DNA 碱基对中并与之结合,在488 nm的激光激发下,在波长660 nm左右检测到红色荧光。因此,通过荧光信号的强弱或有无可知菌体活性的大小或有无,并且该方法可以检测低活性的细胞;如果使用传统的培养法或亚甲基蓝染色法检测低活性细胞,则误差较大。FCM可以作为产品质量控制和菌群生长动态监测的重要手段,与传统方法高度一致,结果可靠,且具有快速、灵敏、便捷的优点。

FCM在临床细菌检测应用

流式细胞术具有快速、灵敏、精确并能进行多参数分析的特点,可广泛应用于细菌的诊断和药敏试验,是研究细菌异质性、细菌抗生素后效应、多种病原菌混合感染等的有效方法。FCM可快速检测抗生素抗菌效应,并利用细胞氧化活性染料CTC检测出几个不同的细胞亚群,因为不同细菌亚群对抗生素的敏感性不同,从而直观地反映细胞异质性。抗生素后效应是指细菌与抗生素短暂接触后清除药物,而细菌生长仍受到持续抑制的效应。流式细胞仪对每一个细菌多参数检测,可同时检测到FSC、FL2变化,提供得出细菌体积增大和DN A含量增加,多参数反映细菌变化,提高了准确性。

FCM在环境样品中的细菌检测应用

自从1993年Wagner等利用FCM对活性污泥中微生物进行群落结构分析以来,该技术逐渐成为空气、土壤、水等环境中微生物学研究中的一项重要工具。Joachimsthal等[3] 对新加坡港的压舱水进行了细菌总数、肠道菌数、弧菌数和大肠杆菌数的检测,可以为压舱水的污染状况提供大量信息。Yamaguchi等[4]使用FCM分别对未污染和污染河水中细菌的呼吸活性和酯酶活性进行了检测,结果发现,菌体酯酶活性对污染状况更敏感,有酯酶活性的细菌比例与河水污染程度呈正相关,可以此作为评估环境水污染的指标。

浮游生物也是造成水质破坏的一大因素,它们常可引起“水花”。所幸,FCM也可用于浮游生物的检测。2012年,Quan Zhou等[5]利用流式细胞术对太湖湖底沉积物中的微胞藻属菌体计数,并对微胞藻聚集体进行了群落分析,表明FCM可以高效监测微胞藻属的群落变化,具有高度适用性。

FCM在趋磁细菌研究中指日可待的应用

流式细胞仪的基本原理及只要所需检测微粒能用荧光染料标记就能被定量检测的特点,推测其可能用于趋磁细菌磁小体合成量的检测。由于趋磁细菌体内合成磁小体,且数量不等,所以磁小体的多少直接影响菌的胞内粒度大小,依据FCM的侧向散射光信息代表细胞的胞内粒度情况,FCM可能是检测趋磁细菌磁小体量的一种方法。当然,这种方法只有能直接标记磁小体才具有说服力,但是目前尚未找到恰当的磁小体荧光探针,因此应用上还有待于趋磁细菌研究的进一步深入。

[1] Bryan PT, Stefan MG, Eleftherios TP. Development and application of flow-cytometric techniques for
analyzing and sorting endospore-forming Clostridia[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(24): 7497-7506.应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性 微生物学通报 2006年33 (6) 2 2

[2] Kim Y, Jett JH, Larson EJ, et al. Bacterial finger-printing by flow cytometry: bacterial species discrimination[J]. Cytometry, 1999, 36(4): 324-332.

[3] Joachimsthal EL, Ivanov V, Tay ST, et al. Bacteriological examination of ballast water in Singapore Harbour by flow cytometry with FISH[J]. Marine Pollution Bulletin, 2004, 49(4): 334-343.

[4] Yamaguchi N, Nasu M. Flow cytometric analysis of bacterial respiratory and enzymatic activity in the natural aquatic environment[J]. Journal of Applied Microbiology, 1997, 83(1): 43-52.

[5] Zhou Q, Chen W, Zhang HY, et al. A flow cytometer based protocol for quantitative analysis of bloom-forming cyanobacteria (Microcystis) in lake sediments[J]. Journal of Environmental Sciences,2012, 24(9): 1709-1716.