90% 的人都栽了！流式凋亡样本制备避坑指南

同样的试剂盒，为啥有人能做出漂亮的象限图，你的数据却直接报废？别愁！问题就藏在样本制备的那些 “魔鬼细节” 里。今天这篇超全避坑指南，手把手教你避开雷区，轻松 get 理想结果。

一、细胞收集 ——90% 假阳性的罪魁祸首！

1.悬浮细胞

（1）用移液枪小心吸取含细胞的培养基，轻轻转移到提前 4℃预冷的离心管中。

（2）设置 500g离心 5 分钟，弃上清时枪头贴壁缓慢吸液。

（3）加入 1ml 4℃预冷的 PBS，用指尖轻弹管底 10 次重悬细胞，重复离心步骤。

禁忌红线：离心速度千万不能超过 600g，不然会导致细胞膜破裂；枪头不能直吹沉淀！

2.贴壁细胞（Accutase 酶消化法，以 6 孔板为例）

（1）弃掉培养基，加入 1ml 4℃ PBS 轻轻晃动洗涤，弃去液体。

（2）加入 1ml Accutase，在室温下孵育 5-10 分钟。

（3）当看到细胞开始圆缩，用手掌轻拍培养皿，让细胞脱落。

（4）温和地吹散细胞，然后转移到 4℃预冷的离心管中。

（5）设置 500g离心 5 分钟，弃上清时枪头贴壁缓慢吸液。

（6）加入 1ml 4℃预冷 PBS，指尖轻弹管底 10 次重悬，重复离心。

特别注意：Accutase 消化时需避免反复吹打细胞团，若细胞贴壁较紧，可适当延长孵育时间但不可超过 1小时，过度消化会导致细胞膜损伤引发假阳性。

二、凋亡诱导与单染管设置（补偿调节的核心关键！）

Step 1 凋亡诱导

  1. 收集 1×10⁶ - 3×10⁶个细胞，用预冷的 PBS 离心洗涤两次，然后弃去上清。

  1. 加入 500μL阳性质控液重悬细胞，放在冰上孵育 30 分钟。

  1. 再用1ml 4℃预冷 PBS 离心洗涤，弃去上清。

  2. 加入适量预冷的 1×Binding Buffer 重悬细胞，同时加入数量相同且未经处理的活细胞混合。接着加入预冷 1×Binding Buffer 补充至 1.5ml，等分成三管，分别作为空白对照管和两管单染管。

Step 2 单染管制备（这一步必须做！，以Annexin V-FITC/PI为例）

管别 加试剂 目标信号
空白对照管 无 全阴性（设门基准）
Annexin V 单染管 5μLAnnexin V-FITC FITC 荧光单阳性
PI 单染管 10μL PI PI 荧光单阳性

三、样本染色

1.实验管：用 500μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，再加入 5μL Annexin V-FITC 和 10μL PI。2.轻柔涡旋一下，让试剂和细胞充分混合。3.在室温下避光孵育 5 分钟。4.放在冰浴中，在 1 小时内上机。

凋亡检测操作演示视频：https://www.liankebio.com/apoptosis-assay-protocol-21126.html

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