流式细胞术之荧光知识

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作者:小科 发布日期:2021-07-26 10:00

(一) 荧 光 知 识

荧光素按激发光波长来分,主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类,其中,常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素,如FITC、PE、APC、PI等。

激 发 波 长 为 488 nm 的 荧 光 素

1) 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC):FITC是应用最为广泛的一种荧光素,经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光,最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大,常随着PH的降低而减弱,因此,在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。

2) Alexa Fluor 488:Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料,Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致,经激光激发后发出绿色荧光,最大发射波长为519 nm,但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说,Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。

3) 藻红蛋白(phycoerythrin,PE):PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料,经激光激发后发出橙黄色荧光,最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点,可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中,PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。

4) PE-Cy5:PE-Cy5是一种复合染料,属于藻红蛋白偶联物,在此类复合染料中,激发能量可从PE传递到Cy5上,最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少,荧光干扰少,因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不适合与APC搭配使用,两者荧光重叠大。

5)PE-Cy5.5:PE-Cy5.5也是一种复合染料,能量从PE传递到Cy5.5上,最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样,PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小,可搭配使用,且其荧光强度要优于PE-Cy5。

6) PE-Cy7:复合染料,最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠,与APC重叠也较少,因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意,PE-Cy7的光淬灭性很强,需要绝对避光环境。

7) PerCP-Cy5.5:复合染料,最大发射波长为695 nm。与PerCP相反,PerCP的光量子产率较低,适用于表达水平较高物质的检测,PerCP-Cy5.5光量子产率高,可用于表达水平较低物质的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时,需要做补偿调节,但比PerCP补偿少。

8) PI/7-AAD:碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的最大发射波长分别为617 nm和647 nm,是常见的荧光染料,常用于细胞凋亡检测,可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上,PI在FL2或FL3通道检测,7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性,但其发射波谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

激 发 波 长 为 633 nm 的 荧 光 素

1) 别藻青蛋白(allophycocyanin,APC):APC最大发射波长为660 nm,其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。

2) Cy5:Cy5属于小分子染料,其最大发射波长为670 nm,其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外,Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是,Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多,实验结果容易出现假阳性。

3) Alexa Fluor 647:Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料,其最大发射波长为668 nm,一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、适宜的pH范围广和不易淬灭等特点,是APC和Cy5的优质替代品。

(二) 荧 光 素 的 选 择

在流式细胞术实验,各种荧光素标记的抗体是必不可少的。那么荧光素该如何选择呢,通常会参考以下5个方面:1. 流式细胞仪配置:仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长:2. 染料的亮度与抗原表达量相匹配:低表达抗原,推荐使用亮荧光染料;高表达抗原,推荐使用弱荧光染料。

3. 荧光染料重叠最小化:尽量选择光谱重叠小的荧光素,如FITC/PE-Cy7;选择不同激光激发的荧光素,如FITC/APC,PE/APC。

光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏,需调节补偿。

4. 避免复合染料联合使用带来的假阳性:常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等,复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。如果出现信号衰退,则:

● 减少样本暴露于光、高温或固定剂;

● 选择染料时考虑:复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度,避免染料和其衍生物在同一细胞上标记。选择更稳定的tandem-dye(PerCp-Cy5.5);

● 如果样本需固定,选择稳定、可有效阻止复合染料信号衰退的固定剂多聚甲醛:冰上固定10min,离心除去多聚甲醛,将样品重悬于PBS中。

5. 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本:每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光,但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞,选择红光激发,发射波长长的荧光素(如APC)可得到较好的S/N比值;对自发荧光比较弱的细胞,发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善,可选用FITC。