PI、7-AAD和DAPI的区别

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PI 7-AAD DAPI
英文全称 Propidium iodide
碘化丙啶
7-amino-actinomycin
D7 氨基放线菌素
4',6-diamidino-2-phenylindole
4, 6-联脒-2-苯基吲哚
染色原理 荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测,英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物,在嵌入双链DNA后释放红色荧光。 7-AAD是一种核酸染料,它不能通过正常质膜,随着细胞凋亡、细胞死亡过程,质膜对7-AAD的通透性逐渐增加,结合细胞凋亡中DNA的有控降解,在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光,通过7-AAD标记DNA的强弱,将细胞分为三群:7-AAD强为死亡细胞,7-AAD弱是凋亡细胞,7-AAD-为正常活力细胞。 DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用,可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光,和EB相比,对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
膜通透性
染色位置 细胞核 细胞核 细胞核
灵敏度
检测通道 使用488nm激发,用610/20BP收集,FL-2检测通道 用488nm激发,用670/14BP收集,FL-3检测通道 用355nm激发,用440/40BP收集;
可用405nm激发,450/50BP收集
能否检测
早期细胞凋亡
不能
缺点 不能区别晚期凋亡和坏死细胞 不能区别晚期凋亡和坏死细胞 强烈致癌
使用方法
  1. 用合适的方法诱导细胞凋亡;
  2. 悬浮细胞离心(1500rpm 离心 5min)收集;贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培养基洗一次(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性);或直接用Accutase酶消化(无需终止);1500rpm离心5min收集细胞;
  3. 用PBS洗涤细胞两次(1500rpm离心5min)收集1-5 X 105细胞,弃上清;
  4. 制备1 X Binding Buffer缓冲液:按10次分析的量计算,加1mL 5 X Binding Buffer缓冲液到 4mL 的去离子水;
  5. 500uL 1 X Binding Buffer重悬细胞(第4步稀释的缓冲液)
  6. 加入5uL annexin-V FITC和10μL PI
  7. 避光室温孵育5分钟
  8. 上机检测
  1. 通过合适的方法来诱导细胞凋亡;
  2. 清洗两次细胞;在第二次清洗后,去除细胞颗粒残留的PBS。
  3. 在冷的1X结合缓冲液重悬细胞,使细胞浓度达到1x106到1x107cells/mL。
  4. 添加100μL细胞(106个)悬液到每管。
  5. 添加5μL Annexin V-PE 和 10μL的7-AAD。
  6. 温柔混匀,冰上孵育15分钟。
  7. 不用清洗,添加1X结合缓冲液到每管。
  8. 流式数据分析。
  1. 稀释DAPI储存液到3 微摩染液(100mM Tris, PH7.4, 150Mm, NaCl, 1mM CaCl2, 0.5mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40),每个细胞样品中需要1 ML。
  2. 在室温下,轻轻弹管使得细胞颗粒分散,添加5mL的PBS,让细胞水化15分钟。
  3. 离心上述的悬浮细胞,弃悬浮液。轻轻弹管使细胞分散,添加1ML的被染液稀释的DAPI容液。
  4. 流式分析染料的存在。如果细胞在绿色荧光显微镜下能够看到,离心样本,去除上清,在新鲜的缓冲溶液中重悬。
  5. 提供一滴到显微载玻片上,用盖玻片盖住,观察。