ELISA通关必备丨数据分析篇

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做完ELISA实验,测完吸光度,数据怎么处理?标准曲线不是直线怎么办?小科整理了ELISA数据处理相关知识,希望对您有帮助。

一、ELISA 标准曲线分析步骤

  1. 标曲和样本孔的每个孔 450nm 的OD值减去630nm(或570nm)的OD值;
  2. 再将获得的标曲和样本孔数据分别减去空白孔Blank的OD值;
  3. 以标曲的浓度为横坐标,以上算出的OD值为纵坐标,拟合标曲(选择R2值大于0.99的比较好的拟合方式,必要时可以删除个别差异较大的标曲点进行拟合);
  4. 计算样本值,将样本减去空白孔的OD值复制,选软件中的“粘贴”,得到的X值再乘以相应的稀释倍数就是最终的浓度值。

二、ELISA 标准曲线拟合方程

  1. 直线回归:直线回归是最基本、简单的回归分析方法,将所有的测试点拟合为一条直线,其拟合函数方程式为:y = a + bx。一般实际实验中线性极好的情况下直线回归可以获得较为理想的R2值,如果直线拟合不理想,可以考虑三次曲线、logistic曲线(四参数)等。
  2. logistic曲线(四参数)拟合回归方程:竞争法和夹心法都可以用到。它要求X值不能小于0(因为指数是实数,故有此要求)。在很多情况下它都可以拟合ELISA的反应曲线,所以它也成了ELISA中应用最广的模型之一。

注:曲线拟合方法虽多,要根据不同类型ELISA本身的特点,选择最适合的曲线拟合模型,才能得到最合理的实验结果。一般情况下,需要综合考虑标准曲线的趋势走向以及R2值的大小以及样本落值情况。