RNA实验方案和应用新手必读(三)

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作者:QIAGEN官网 发布日期:2015-03-08 05:00

RNA分离:起始材料的破碎和匀浆

起始材料的有效破碎和匀浆对于所有总RNA分离操作来说都是必须的要求。破碎和匀浆是两个独立分开的步骤。

? 破碎:对于组织结构、细胞壁和细胞质膜的彻底破碎对于释放样本中所有的RNA是绝对必要的。不同样本需要使用不同的方法以达到彻底的破碎效果。不完全的破碎会导致RNA得率的显著降低。

? 匀浆对于减少破碎后细胞裂解产物的粘性是十分必要的。匀浆能够切断高分子量的基因组DNA及其他高分子量的细胞组分,得到均匀的裂解产物。匀浆不够彻底会导致RNA结合效率的下降而显著降低得率。

某些破碎方法能够同时对样本起到匀浆作用,而其他方法还是需要专门的匀浆步骤。表针对不同样本进行破碎和匀浆的准则全面概述了适用于多种起始材料的不同破碎和匀浆方法。当您针对所使用的起始材料选择合适的操作方法时,该表格可用来作为参考。下面也将针对破碎和匀浆方法进行更为详细的论述。

使用玻珠研磨机进行破碎和匀浆

在使用玻珠研磨机破碎样本的过程中,样本与珠子被一起进行高速搅拌。通过珠子与细胞碰撞时的流体动力切割和破碎作用,同步完成破碎和匀浆过程。破碎效率的影响因素有:

? 珠子的大小和组成

? 缓冲液与珠子的比例

? 起始样本的数量

? 搅拌速度和设定

? 处理时间

细菌破碎时所使用的理想珠型为0.1毫米(平均直径)的玻璃珠,用于酵母和单细胞动物细胞时为0.5毫米的玻璃珠,对动植物组织则应使用3–7毫米的不锈钢珠。请确保玻璃珠经过浓硝酸的预先润洗。或者可直接购买和使用市售的经酸洗涤过的玻璃珠。关于破碎的其他参数需要依据每一应用的经验进行设定。植物材料以及相关的珠子和破碎管可先在液氮中预冷,破碎应在无裂解缓冲液的条件下进行。对于动物组织则应使用干燥的冷冻粉碎。冷冻粉碎(无论是在玻珠研磨机中还是使用研钵和杵)不同于缓冲液裂解,不会对样本同时起到匀浆作用。

使用转子——定子匀浆器进行破碎和匀浆

在裂解缓冲液的存在下,转子–定子匀浆机可同时完成对动物组织的彻底破碎和匀浆,所需时间基于样本的坚韧程度,可在5–90秒内完成。转子–定子匀浆机也可以用于细胞裂解产物的匀浆。转子的超高速旋转能够以扰动和机械剪切的综合方式,完成对样本的破碎和匀浆。使用适当大小的管子,在匀浆过程中始终保证匀浆器头部一直处于浸没状态,并持续将匀浆器头部伸入管子末端,以确保匀浆过程中样本内的泡沫达到最少。转子–定子匀浆机有不同大小型号可供选择,并可装配不同大小的探头。5 mm和7 mm的探头适合在300 µl以下的体积内使用,并可用于离心管内的匀浆。10 mm及以上尺寸的探头则适用于更大的管子。

使用研钵和杵破碎

使用研钵和杵破碎时,先将样本进行迅速的液氮冷冻,并在液氮中将其研磨为细粉。将上清液(组织粉末和液氮)转移至液氮预冷的适当大小的管中,使液氮挥发但不要让样品融解。加入裂解缓冲液,并尽可能快地进行后续步骤。

注:使用研钵和杵研磨样品会破碎样品,但无法达到匀浆的目的。匀浆作用需与此步骤分开进行。

使用注射器和针头完成匀浆

细胞和组织的裂解产物可以使用注射器和针头进行匀浆。可以使用20号(0.9 mm)针头连接一个灭菌塑料注射器,通过至少5–10次的吹打切断高分子量的DNA,直至裂解产物的匀浆形成。为操作便利和减少样品损失,也可能需要增加裂解缓冲液的体积。

针对不同样本进行破碎和匀浆的准则

起始材料 破碎方法 匀浆方法 评论
培养的动物细胞 加入裂解缓冲液 使用转子–定子匀浆机或注射器和针头获取胞质RNA 如果处理少于1x105个细胞,可以使用涡动匀浆裂解产物。不提供匀浆方案。
动物组织 转子–定子匀浆机 转子–定子匀浆机 同步进行破碎和匀浆
动物组织 研钵和杵 注射器和针头 使用转子–定子匀浆机和玻珠研磨机通常比使用研钵和杵的得率更高。
动物组织 玻珠研磨机 玻珠研磨机
细菌 加入裂解缓冲液进行酶 (溶菌酶)解 涡旋机 如果处理大于5x108个细胞,使用注射器和针头进行匀浆可能会增加得率。
细菌 玻珠研磨机 玻珠研磨机 玻珠研磨机可同时完成破碎和匀浆;不能使用涡动操作代替玻珠研磨机。
酵母 酶解(溶菌酶/消解酶)细胞壁后加入裂解缓冲液, 以消化原生质球。 涡旋机
酵母 玻珠研磨机 玻珠研磨机 玻珠研磨机可同时完成破碎和匀浆;不能使用涡动操作代替玻珠研磨机。
植物和丝状真菌 研钵和杵 注射器和针头 研钵和杵不能代替转子–定子匀浆机。

从不同样本来源分离RNA的特别注意事项

一些样本来源在其RNA或内含物方面存在着显著不同,可能导致RNA的分离和分析过程出现问题。当操作这些样本来源时需要一些特别注意事项。本节将针对大量不同样本来源的操作进行探讨。

植物

从植物材料中分离RNA会遇到一些特殊困难,常规技术在用于植物样本之前一般要先经过条件优化。一些植物代谢产物的化学性质与核酸相似,导致其难于从RNA制备产物中除去。(使用不当的)纯化方法(如盐类或苯酚)所导致的代谢物(例如多糖类、多酚类和黄酮类)或污染物与目的RNA的共分离,可能造成对酶促反应的抑制,或导致紫外分光光度测定和凝胶电泳结果上的偏差。从植物材料中分离RNA的过程中可能遇到的困难还包括由于较高粘性导致的吸取体积错误,以及储存过程中的RNA降解问题。

通常对植物的生长条件进行优化,使其不产生高水平的植物代谢产物,可有助于对RNA的有效分离。由于植物种类之间存在较大差异,因此对其生长条件很难有同一的指导标准。不过作为普适原则,建议尽可能使用健康幼嫩的植物组织。年轻植物组织的RNA得率通常高于年老组织,因为前者在等重条件下通常比后者包含更多的细胞。而且等重的年轻组织通常也包含更少的代谢物。此外,许多“自定义”的RNA分离方法都推荐将植物组织在黑暗中培养1–2天后再进行收获,以避免形成植物代谢物的高水平积累。

心脏、肌肉和皮肤组织

从例如骨骼肌、心脏和皮肤组织一类的样本中分离RNA可能比较困难,因为此类样品中含有大量的收缩性蛋白、结缔组织和胶原。为了去除这些可能对RNA分离造成干扰的蛋白,需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解试剂对此类样本进行处理。不过,蛋白酶的消化过程需要避免RNA发生降解。

细菌

细菌mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA没有5'帽子,也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA无法通过杂交进行捕获。另外,也无法在合成初始链的过程中使用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷(oligo–dT)引物,只能使用随机引物作为替代。

此外,细菌RNA也十分地不稳定,快速生长的品种中RNA的平均半衰期约为3分钟。某些细菌的mRNA在翻译同时即发生降解。因此对于尝试从细菌中分离mRNA的研究人员来说,这可算是一个大麻烦。也由于细菌中的mRNA的周转(从生成到降解)非常快,造成原核生物的基因表达研究比真核生物更为困难。为了精确地保留基因表达谱,并使完好mRNA的得率最大化,在样本获取和加工之前需要对其进行稳定处理。

血液

血液直接源于临床分析的收集样本。在收集管中使用RNA稳定处理试剂可成功保存血液样本的RNA。从血液中分离RNA的方法,需要能够确保生成无污染物或酶抑制剂的高质量RNA。血液中所含有的大量酶抑制剂会对下游的RNA分析造成干扰。此外,如肝素和EDTA等一类常规的抗凝血剂也会干扰下游分析。应注意抗凝血剂并不会对RNA起到稳定化作用。

人类血液中的红血球(血红细胞)不含细胞核,因此不会合成RNA;通常情况下这类细胞仅含有非常微量的RNA,而不是RNA分离的主要对象。从全血中分离RNA的主要靶标细胞为白血球(白细胞),这类细胞含有细胞核和RNA。白血球由三种主要的细胞类型构成:淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。

由于健康的血液中所含的红细胞数量约为白细胞的1000倍,去除红细胞会有助于简化RNA分离步骤。可通过选择性地裂解红细胞来达到此目的,因为红细胞对低渗休克更为敏感(相比白血球),在低渗缓冲液中会迅速发生破裂。

裂解红细胞的另一种常见替代方法是Ficoll密度——梯度离心法。与红血球裂解法不同,Ficoll密度——梯度离心法仅获取单核的细胞(淋巴细胞和单核细胞),而会去除粒细胞。经Ficoll密度––梯度离心法分离出的单核细胞能够使用与其他动物细胞一样的方法进行RNA分离。

FFPE组织样品

福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)的组织样本是生物医学研究中的重要和广泛的样本来源。越来越多的研究者开始针对FFPE样本开始分子水平的分析,因此考虑这些样本的独特属性以发展针对性的分离方法变得越来越重要。

由于在固定和包埋过程中使用了甲醛,通常会使FFPE样本中的核酸发生严重的片段化和化学改变。因此,从FFPE样本中分离到的核酸会比新鲜样本或冰冻样本的分子量更低。其片段化程度基于样本类型、保存期长短,以及固定、包埋和储存的条件而发生变化。尽管在凝胶电泳或芯片实验室(lab–on–a–chip)分析等标准质量控制分析中无法测得甲醛修饰情况,但后者实际会对酶学分析造成严重干扰。

为了将FFPE储存法对RNA转录物的影响降至最低,应牢记下列小贴士:

? 尽可能快地取样和固定组织

? 不要使用厚度超过5 mm的样本,样本固定时间不宜过长(最长24小时)

? 使用优质的试剂进行石蜡包埋,不要加入其它添加剂

? 尽可能避免对样本进行染色

? 适当地储存FFPE样本(RNA在4°C可完好保存至1年,优于保存在室温或更高温度)

? 使用适当的脱石蜡步骤

? RNA分离应包含一个解交联的步骤

特定RNA病毒

病毒 基因组
Adenoviridae Adenovirus dsDNA
Arenaviridae Lassa virus ssRNA
Bornaviridae Borna disease virus ssRNA
Bunyaviridae Hantaan virus ssRNA
Caliciviridae Hepatitis E virus, Norwalk virus ssRNA
Filoviridae Ebola virus ssRNA
Flaviviridae Hepatitis C and G viruses, Dengue virus ssRNA
Hepadnaviridae Hepatitis B virus ss/dsDNA
Herpesviridae Herpesviruses (HSV; CMV; EBV; HHV6, 7, 8) dsDNA
Papovaviridae Human papillomavirus, JC virus ssDNA
Paramyxoviridae Parainfluenza virus, respiratory syncytial virus, rubulavirus ssRNA
Parvoviridae Parvovirus B19 (erythrovirus) ssDNA
Picornaviridae Coxsackie virus, foot-and-mouth disease virus, hepatitis A virus, poliovirus, rhinovirus ssRNA
Reoviridae Rotavirus dsRNA
Retroviridae Human foamy virus, human immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus ssRNA
Rhabdoviridae Rabies virus ssRNA

RNA的储存

纯RNA可以储存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述条件下,1年内都不会发生RNA降解。