类器官(Organoids)概述:什么是类器官?类器官研究进展、操作步骤及常见培养实例

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类器官(Organoids) 培养皿中的微器官

什么是类器官

培养基中的微器官:类器官模型是一种3D(三维)细胞培养系统,其与体内的来源组织或器官高度相似。这些3D系统可复制出已分化 组织的复杂空间形态,并能够表现出细胞与细胞、以及细胞与基质之间的相互作用。理想状态下,类器官与体内分化的组织具有相似的生理反应。这不同于传统的2D(二维)细胞培养模型,后者在物理、分子和生理学等特性上通常 与来源组织的相似性很低。

虽然最早的3D类器官模型创立于40年前,但是其应用直到最近仍很有限,这是因为早期的类器官模型需要大量 起始细胞、不适于高通量筛选、而且经常呈现出较低的体外活力[1]。随着多能干、祖细胞分离技术的提高,早期类 器官模型的缺陷大部分均得以克服,这使得研究人员能够研发出高重复性、寿命长的类器官。

类器官技术的快速发展,以及对于多种体内和体外结构广泛而随意地使用类器官这个术语,让Lancaster 和 Knoblich觉得有必要对类器官下一个基本的定义。他们将类器官定义为:“器官特异性细胞的集合,这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来,并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建”。

根据Lancaster和Knoblich的定义,类器官应该具有和器官一样的若干重要特征:

  1. 必须包含一种以上与来源器官相同的细胞类型;
  2. 应该表现出来源器官所特有的一些功能;
  3. 细胞的组织方式应当与来源器官相似[2]

类器官研究进展

这一切是怎样开始的?

2009年,Hans Clevers和其实验室的博士后Toshiro Sato用来源于小鼠肠道的成体干细胞培育出首个微型肠道 (mini-guts)类器官[3]。后来,他们将这个方法扩展到人上皮类器官的培养上[4]。这些类器官可能会使研究者对肠道 的健康与疾病,包括结直肠癌等产生新的认知[3, 4]。

这个方法启发了其他科学家,他们从小鼠和人的组织中培育出多种类器官。这些类器官细胞团块小到没有血液 供应仍能存活,然而又足够大和复杂,可以告诉我们组织和整体器官的发育和生理学方面的一些信息。

类器官培养操作步骤

类器官制备的典型方法首先要分离出胚胎或多能干细胞,然后将它们培养在一个支持介质(如基质胶Matrigel)上, 使其能够三维生长。类器官中包含多种已分化的细胞类型,这些细胞类型在体内相应的器官中也有存在。比如,小肠 上皮的所有细胞类型在Sato等报道的小肠类器官模型中均有体现[3]。介导类器官形成的信号通路与体内器官发育与 稳态维持的信号通路是相同的,因此,细胞因子、生长因子和小分子也要添加到培养基中,以激活或者抑制参与类器 官形成的特定信号通路。制备不同的类器官需使用不同的添加物组合,即使对于小肠和结肠等结构非常相近的组织, 添加物的组合也不尽相同[4]。

类器官的培养有多种不同的方法,其中一些刚刚开始探索。下文将给出类器官培养的一些实例,并着重介绍细 胞因子、生长因子和小分子在其中的使用。

常见的类器官培养实例

胃肠道(GUSTROINESTINAL,GI)类器官

过去,对于胃肠道(GI)的基础医学研究,完全依靠动物模型和肿瘤细胞系,然而后者与人体生理学的相关性非常有限,因此从人类细胞获得GI类器官具有非常重要的意义[4, 5]。

小肠的上皮层由纤细、微小的突起,即肠绒毛(villi)组成。绒毛的基部有称为隐窝(crypts)的龛状结构,这里是负 责肠粘膜持续更新的小肠干细胞的栖息地。在最初培育小鼠小肠类器官时,培养基中添加了EGF(表皮生长因子), R-spondin-1和Noggin等生长因子[3]。后来发现,培养小鼠结肠类器官时,除上述三种生长因子外,还需添加Wnt-3A。 对人类小肠及结肠类器官的研究表明,除了上面所提到的4种生长因子(EGF,R-spondin-1,Noggin和Wnt3A)外,还 需要加入p38 MAP激酶抑制剂(SB 202190)和TGF-β抑制剂(A-83-01)[4]。

最近的研究显示,从人胚胎干细胞(ESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)在体外培育得到的人小肠类器官(HIO)移 植入体内后可形成有功能的成熟小肠组织。为诱导形成定向内胚层(definitive endod,erm DE),人ESCs或iPSCs需先 用含Activin A的培养基培养,然后在含Activin A,FGF-4和GSK3抑制剂(CHIR99021)的培养基中培养形成球 状体(spheroids)。这些球状随后被放置在Matrigel中,并用添加了EGF和Noggin的小肠生长培养基维持培养,即可产 生上述的HIO。最后,研究人员将HIO移植到免疫缺陷小鼠的体内进行观察[6]。

脑类器官

人类大脑的高度复杂性,使得许多关于脑疾病的研究很难在生物模型中开展,所以亟需建立一个人脑发育的体外模型。

现有一种可生成3D脑组织,即所谓的脑类器官的方法,该方法很好地模拟了脑器官的内源性发育过程。利用该方法,使用患者特异性的iPSCs(诱导多能干细胞) 培育出头小畸型(microcephaly) 的人3D类器官,为研究人头小畸型的 发生机制奠定了基础。过去通常用小鼠模型来研究人的头小畸形,但小鼠与人的较大差异导致此项研究的失败。人头 小畸型类器官的具体制备方法是将患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPSCs,然后在添加了FGF-basic(碱性成纤维细胞生长因子),CHIR 99021和MEK抑制剂(PD 0325901)的培养基中培养21天。快速增长的克隆被挑出,并传代于经灭活 处理的CF-1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上生长。随后,将单个细胞接种在添加了低浓度的FGF-basic和高浓度的ROCK 抑制剂(Y27632) 的培养基中培养,形成神经上皮组织后转移至Matrigel胶滴(droplets)中,经过一段时间的静态生长, 将这些组织胶滴转移到旋转生物反应器中,并加入含有维甲酸的分化培养基进行培养。通过分析这些患者的类器官, 研究人员发现过早的神经元分化,这可能是导致疾病表型的原因[7]。

来源于iPSCs的类器官神经培养技术也用于研究重症特发性自闭症谱系障碍(ASD)病人的神经发育改变。类胚体 (embryoid bodies, EBs)从经Y 27632预处理的未分化iPSCs克隆获得,然后用Accutase消化形成单细胞,并接种于添 加了Y 27632和重组小鼠Noggin 的培养基中培养,以诱导前脑(forebrain)的形成。之后,为形成神经花环(neural rosettes),收集自由悬浮的EBs并铺板于包被有Matrigel的组织培养皿中,加入添加了Noggin的神经元培养基。第二天, 神经元培养基换液,并添加FGF2,Noggin和人Dkk1。两三天后,手动分割神经花环并将自由悬浮的细胞团块铺板于 玻璃培养皿(Petri dish)中,加入含FGF2和EGF的神经元培养基。悬浮培养五天后,将自由漂浮的细胞团块以单个团块 的形式铺板于具有超低附着力(ultra-low-attachment)的96孔板中,继续用含有FGF2和EGF的神经元培养基培养,随后 在含有BDNF和GDNF的培养基中完成终末分化[8]。

B细胞滤泡类器官

初始(Naïve)B细胞遇到抗原时,会在淋巴结或脾脏中形成细胞聚团,即生发中心。在生发中心中,B细胞增殖、突变以产生高亲和力抗体、并进行克隆扩增。到目前为止,使用2D(二维)细胞培养很难在体外重现这一过程。

B细胞滤泡类器官并非使用传统的Matrigel 3D培养方法,而是用明胶(gelatin)和硅酸盐纳米颗粒(silicatenanoparticle) 混合物来模拟体内淋巴器官的微环境。从脾脏获得的初始B细胞与表达CD40L和B细胞活化因子(BAFF)的转基因基质细胞共同培养在由硅酸盐纳米颗粒加固的水凝胶支架中,培养基中含有小鼠的IL-4。比2D培养快得多,只需经过数天的时间,这些类器官中的B细胞即可成熟并发生类别转换(class switching)[9]。

肝脏类器官

肝的发育涉及到来自内胚层和中胚层的组织之间复杂的相互作用。肝脏最初起源于内胚层中前肠上皮细胞发育而来的肝芽结构,肝芽来源的肝母细胞形成肝细胞和胆管上皮细胞,而肝脏成纤维细胞和星状细胞是由附近的中胚层来 源的间质(mesenchyme)分化而来[10]。

最近建立了一种培育人类肝芽样组织的方法,使用三种细胞群体的混合物,模拟了肝发育早期的三个细胞系别,即人多能干细胞(PSC) 来源的肝细胞、人间充质干细胞和人内皮细胞。进行内胚层分化时,将人iPSCs 接种于包被有 Matrigel的培养皿中,加入含Activin A的培养基进行培养。人iPSCs来源的内胚层细胞随后用含人FGF-basic和人BMP4 的培养基培养,以制备肝内胚层细胞,即iPSC-HEs。人iPSC-HEs然后与基质细胞(包括人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人间充质干细胞(MSCs)共培养。这些细胞当以高密度与一层Matrigel混合后会自发形成三维肝芽。将这些肝芽移植入小鼠体内后会有血管生成,并呈现出肝脏所特有的功能,移植鼠在药物诱导的致死性肝衰竭模型中可以存活[11]。

视网膜类器官

视网膜是眼睛中感受光线的神经区域,它来源于神经外胚层。眼睛是由多种细胞以三维方式组成的高度复杂的器官,视网膜作为眼睛的一部分,其结构也相当复杂。视网膜发育的早期阶段会形成两个相邻的上皮细胞层,即外侧的 视网膜色素上皮层和内侧的神经视网膜层,最终生成含有光受体层和支持细胞层的组织[12]。

视杯类器官来源于人ESCs(胚胎干细胞),从小鼠ESCs也可制备出相似的类器官。进行视网膜分化时,hESCs在 含有Y 27632的视网膜分化培养基中再聚集(reaggregated),培养的第2天到第18天期间加入Matrigel。为形成视杯细 胞,需要在培养的第15天到第18天添加CHIR 99021(或重组Wnt3A)和重组人Sonic Hedgehog(Shh)到分化培养基中。 这些人视网膜类器官和小鼠的视网膜有许多相似的特征,但同时也具有人视网膜的一些特点。突出的特点是,人类的 视网膜类器官较大,需要更多的时间进行发育,并且可以长成含视杆细胞和视锥细胞的多层组织,而视锥细胞的分化 在小鼠ESCs的培养中非常罕见[13]。
肾脏类器官
肾脏是中断中胚层(intermediate mesoderm,IM)通过IM来源的后肾间质(metanephric mesenchyme,MM)和成形 的输尿管芽(ureteric bud,UB) 相互作用分化而成。MM来源的肾祖细胞是肾单位的前体,而IM自身则源于后部原条 (posterior primitive streak)[14]。

在经辐照的小鼠胚胎成纤维细胞上培养的人hESCs铺板于包被有Matrigel的96孔培养板中,过夜培养后加入含 Activin A和BMP-4,或只含CHIR 99021的无血清培养基,然后培养在含有FGF-9和肝素的培养基中诱导IM细胞的形成。 这些细胞随后在含有FGF-9,BMP-7和维甲酸(前面用Activin A/BMP-4诱导的细胞)或者含有FGF-9和肝素(前面只用 CHIR 99021诱导的细胞)的培养基中培养。诱导肾脏类器官时,将人hESCs来源的肾脏细胞分离成单个细胞,离心形成 细胞沉淀,然后铺于覆有IV型胶原蛋白的滤膜上,并使滤膜悬浮在培养基中。该研究在化学成分明确的培养条件下,利 用参与正常胚胎发育的生长因子,成功地使hESC分化生成UB和MM,并最终在体外自组形成含有肾单位的3D结构[15]。

类器官的治疗潜力

未来类器官的研究将主要集中于疾病模型,如发育障碍、遗传疾病、癌症和退行性疾病等。使用患者的iPSCs可建 立非常有价值的疾病模型,当动物模型短缺时尤为重要。类器官可以实现对药物的药效和毒性进行更有效地检测,因为 类器官可直接由人类细胞生成,从而避免了因动物和人类细胞间的差异而导致的检测结果的不可靠性。类器官的药物 测试也可能会极大地减少动物在临床前试验中的使用。在体外构建用于移植的组织和器官是条漫漫长路,希望类器官 能使其更进一步。尽管类器官的前景广阔,但仍有很多困难亟待解决,比如成熟度不易控制,以及缺乏血管等。

类器官培养相关细胞因子产品列表

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产品名 货号
Activin A 96- 120-14
BAFF 96- 310-13
BDNF 96- 450-02
BMP-4 96- 120-05
BMP-7 96- 120-03
CD40L 96- 315-15
Dkk1 96- 120-30
EGF 96- AF-100-15
FGF-4 96- 100-31
FGF-9 96- 100-23
GDNF 96- 450-10
IL-4 96- 214-14
Noggin 96- 120-10C
R spondin 96- 120-38
Sonic Hedghog (Shh) 96- 100-45
Wnt3A 96- 315-20
p38 MAP kinase inhibitor (SB 202190) 96- 1523072
CHIR 99021 96- 2520691
MEK inhibitor (PD 0325901) 96- 3911091
ROCK inhibitor (Y 27632) 96- 1293823
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参考文献

1. Stoker AW, Streuli CH, Martins-Green M et al. Designer microenvironments for the analysis of cell and tissue function.Curr Opin Cell Biol1990; 2:864 –874.

2. Lancaster MA, and Knoblich JA, Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.Science ,2 014 345:1247125.

3. Sato T, Vries RG, Snippert HJ et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.Nature 200 9; 459:262–265.

4. Sato T, Stange DE, Ferrante M et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’sepithelium. Gastroenterology 2011; 141: 1762–1772.

5. Wildenberg ME, van den Brink GR. A major advance in ex vivo intestinal organ culture. Gut 2012;6 1:96 1-962.

6. Watson CL, Mahe MM, Múnera J, et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat. Med.2 014; 20:1310-1314.

7. Lancaster MA, Renner M, Martin C-A, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.Nature. 2013; 501:373–379.

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10. Zhao R and Duncan SA, Embryonic development of the liver.Hepatology 2005 41:956–967.

11. Takebe T, Sekine K, Enomura M, et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.Nature,2 013 499:481-484.

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