实验干货｜流式法检测 Raw264.7 细胞 M1/M2 亚型比例，步骤 + 试剂清单一键收藏！

做巨噬细胞极化研究的小伙伴看过来！本文整理了流式细胞术检测 Raw264.7 细胞中 M1、M2 型巨噬细胞比例的完整实验方案，从样本处理到试剂选择全涵盖，新手也能轻松上手～

1 实验核心原理

Raw264.7 细胞经诱导后可分化为 M1、M2 两种亚型，通过特异性荧光抗体标记，结合流式检测可计算两种亚型的比例：

  • M1 型巨噬细胞：表达CD86（表面标志物，无需破膜）
  • M2 型巨噬细胞：表达CD206（胞内标志物，需固定破膜）

2 Step-by-Step 实验流程

细胞样本收集（关键：避免细胞损伤）

  1. 针对贴壁生长的 Raw264.7 细胞，先用预冷的 PBS轻轻洗涤 1 次；
  2. 再次加入预冷的 PBS，用细胞刮刀轻柔刮下细胞，制备成单细胞悬液，经 200 目筛网过滤去除细胞团块；
  3. 将过滤后的细胞悬液转移至离心管中，以 300×g 转速离心 5 分钟，弃去上清液；向离心管中加入约 1mL 1× 流式染色缓冲液（Flow Cytometry Staining Buffer）重悬细胞，用移液枪轻轻吹打使细胞分散均匀，随后进行细胞计数，并调整细胞浓度至1×10⁷ cells/mL；
  4. 按实验设计分 4 组，每管加入 100μL 调整好浓度的细胞悬液，分组详情如下表：

分组类型 处理方式 核心作用
阴性 / 空白对照 不进行任何抗体染色 排除细胞自身荧光干扰，设定基础信号阈值
单染 / 单阳对照 仅染 CD86-PE 抗体 / 仅染 CD206-APC 抗体 调整流式仪器补偿，确保两种荧光信号不串扰
同型对照(可选) 染 CD86、CD206 对应的同型对照抗体 排除抗体非特异性结合的干扰，验证染色特异性
实验组 按实验设计（如不同诱导条件）染 CD86-PE+CD206-APC 抗体 检测目标样本中 M1、M2 型细胞的实际比例

Fc 封闭（减少非特异性结合）

在进行抗体染色前，向每管 100μL 细胞悬液（含 1×10⁶ cells）中加入 0.5~1μg Fc 受体封闭剂（Anti-Mouse CD16/CD32, Purified (Clone:2.4G2) 功能抗体），置于冰上孵育 5-10 分钟；孵育结束后无需洗涤，直接加入适量抗体进入后续孵育步骤。

抗体孵育（关键：全程避光）

Ⅰ表面染色（CD86-PE）

向对应流式管（单染管、全染管、CD86 同型对照管（若有））中加入表面染色流式抗体 Anti-Mouse CD86, PE（CD86 同型对照管需加入 CD86 同型对照抗体），室温下避光孵育 15 分钟。

Ⅱ固定破膜 + 胞内染色（CD206-APC）

  1. 向完成表面染色的细胞悬液中加入 100μL FIX & PERM Medium A（固定破膜剂 A 液），轻轻震荡混匀，室温下避光孵育 15 分钟；
  2. 加入 1mL 预冷的1× 流式染色缓冲液，以 300×g 转速离心 5 分钟，弃去上清液；
  3. 向离心管中加入 100μL FIX & PERM Medium B（固定破膜剂 B 液），再加入 5μL Anti-Mouse CD206, APC（Clone:C068C2）流式抗体检测试剂（CD206 单染管、全染管、CD206 同型对照管需加入 CD206 同型对照抗体），轻轻震荡混匀，室温下避光孵育 15 分钟。

Ⅲ洗涤

向完成胞内染色的细胞悬液中加入 1mL 1× 流式染色缓冲液，以 300×g 转速离心 5 分钟，弃去上清液。

Ⅳ上机检测

向洗涤后的细胞沉淀中加入 500μL 1× 流式染色缓冲液，轻轻吹打重悬细胞，立即将细胞悬液上流式细胞仪进行检测。

3 联科配套试剂清单（直接抄作业）

4 实验 Tips

  1. 所有离心步骤建议使用水平离心机，可有效避免细胞聚团，保证细胞分散度；
  2. 抗体孵育（包括表面染色和胞内染色）全程需严格避光，可在冰盒或孵育盒外包裹锡箔纸；
  3. 固定破膜剂 A 液、B 液需按 “先 A 后 B” 的顺序使用，不可颠倒，否则会影响固定和破膜效果；
  4. 同型对照管染的抗体除同型对照抗体外，全染管还要染另一个不是同型对照的指标，如CD206的同型对照管里面染的抗体是CD206的同型对照抗体+CD86抗体。
  5. 上机检测前需观察细胞悬液状态，若存在沉淀，可轻轻吹打或再次过 200 目筛网，避免堵塞流式细胞仪管路。