流式样本单细胞悬液的制备方法

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 流式样本单细胞悬液的制备方法

想要流式染色结果好,必须用单细胞悬液,细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。从固态组织样本中制备单细胞悬液需要借助机械分离和(或者)酶消化。操作条件和酶的选择等需要根据经验进行一定的调整。以下是将四种常见的流式样本制备成单细胞悬液的方法。

一:组织培养细胞

所需试剂器皿

  1. Accutase酶 (联科生物 Cat#AT001)
  2. 流式染色缓冲液(联科生物Cat#S1001)
  3. 15或50mL离心管

实验步骤

  1. 对于悬浮生长的细胞,将细胞转移至离心管中,进行计数和活力分析后进入第3步;
  2. 对于贴壁生长的细胞系,我们推荐用Accutase酶将细胞从培养皿中消化下来并分离聚集细胞。将细胞转移至离心管中进行计数和活力分析后进入第3步(注意:Accutase酶会改变某些细胞的表面抗原表位);
  3. 离心后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/mL。

二、淋巴组织细胞

一般来说机械分离淋巴组织足够将细胞释放为单细胞悬液。

所需试剂器皿

  1. 60mm×15mm的组织培养皿
  2. 3ml注射器
  3. 细胞过滤器(尼龙滤网)
  4. 流式染色缓冲液(联科生物Cat#S100)
  5. 15或50ml离心管

实验步骤

  1. 将获得的组织(脾脏、淋巴结、胸腺)放入到组织培养皿中,用3ml注射器活塞加压的方法把组织分散为单细胞悬液(或者可以在10ml流式染色缓冲液总用两片载玻片把组织压成糊状);
  2. 用10ml流式染色缓冲液收集细胞,并将细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片。将悬液收集到离心管中;
  3. 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
  4. 重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;
  5. 重复步骤3后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。

三、非淋巴组织细胞

所需试剂器皿

  1. 剪刀或手术刀片
  2. PBS或其他合适的生理缓冲液
  3. 60mm×15mm的组织培养皿
  4. 3ml注射器
  5. 细胞过滤器(尼龙滤网)
  6. 流式染色缓冲液(联科生物Cat#S100)
  7. 15或50ml离心管

实验步骤

  1. 将组织用剪刀或手术刀片弄成2-4mm大小的碎块;
  2. 加入用PBS稀释的适量的酶,最佳孵育的时间和温度参考所用酶的操作说明书(注意:酶的种类取决于组织的类型;
  3. 用移液枪轻轻吹打分散细胞后,用过滤器过滤除去细胞团和碎片,收集细胞悬液至离心管中;
  4. 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
  5. 用PBS重悬细胞,去除多余的酶溶液;
  6. 按步骤4的方法离心;
  7. 重复步骤5和6;
  8. 用流式染色缓冲液重悬细胞,并进行计数和活力分析;
  9. 按步骤4的方法离心,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。

从全血中分离PBMC

所需试剂器皿

  1. PBS
  2. Ficoll或者其他密度梯度分离液
  3. 流式染色缓冲液(联科生物Cat#S100)
  4. 15或50ml离心管

实验步骤

  1. 将全血用PBS 1:1在锥形管中稀释;
  2. 在稀释的样本上面加入等体积的Ficoll;
  3. 1000g离心20min;
  4. 将位于PBS和Ficoll层间的PBMC转移到一个新的管中;
  5. 加入PBS清洗细胞;
  6. 4℃,300-400g离心细胞悬液4-5min,去除上清液;
  7. 用流式染色缓冲液重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;
  8. 重复步骤6后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2 × 107/ml。