收藏！！Annexin V检测细胞凋亡

细胞凋亡的概念

细胞凋亡（Apoptosis）：属于细胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD），是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，属于细胞的“自杀”行为。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物中去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。

细胞死亡的方式主要分为凋亡、坏死、自噬和焦亡4类。其中凋亡属于细胞的“自杀”行为，而坏死是由外来因素（化学、物理、生物等因素）作用引起的细胞意外的被动的死亡，属于细胞的“他杀”行为。以下列出细胞凋亡与坏死的部分区别：

区别点 细胞凋亡 细胞坏死
起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤
范国 单个散在细胞 大片组织或成群细胞
细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损
染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状
细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解
细胞体积 固缩变小 肿胀变大
凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬
基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状
蛋白质合成 有 无
调节过程 受基因调控 被动进行
炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物

细胞启动凋亡到凋亡晚期期间，细胞会发生一系列时序性的特征变化，研究人员可通过检测此类特征以判断细胞是否发生凋亡及凋亡所处时期。通常检测Caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）活化、线粒体膜电位丧失、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和DNA断裂等特征。以下为Annexin V法检测细胞凋亡（细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻特征）内容：

Annexin V 细胞凋亡检测原理

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，在正常细胞中，PS分布于细胞膜脂质双层的内侧，当细胞发生凋亡时，细胞膜上这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V 是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，在高钙环境下，Annexin V高亲和力结合PS，通过检测标记Annexin V的荧光判断PS是否发生外翻。

细胞膜PS外翻并不是细胞凋亡所独有的特征，在细胞发生坏死早期，细胞膜即发生破损，导致Annexin V也可结合到PS，因此无法单凭Annexin V区分凋亡细胞和坏死细胞。此时，PI、7-AAD等核酸染料就必不可少啦。凋亡早期细胞和活细胞由于细胞膜仍保持完整，PI等无法通过细胞膜染DNA，而坏死细胞的DNA可被PI着染而产生红色荧光。如下流式细胞术双参数散点图上，左下象限为活细胞（Annexin -/PI-），右上象限为凋亡晚期细胞或坏死细胞（Annexin +/PI+）、右下象限为凋亡早期细胞（Annexin +/PI-）。

Annexin V 细胞凋亡检测步骤

仪器参数调节

  1. 收集1×106 - 3×106 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤两次，弃上清。
  2. 加入500 μl Apoptosis Positive Control Solution重悬，置冰上孵育30分钟。
  3. 用预冷PBS离心洗涤，弃上清。
  4. 加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer 补充至1.5 ml，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。
  5. 单染管分别加入5 μl Annexin V-FITC或10 μl PI，室温避光孵育5分钟。
  6. 在流式细胞仪上，用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。

注：某些将贴壁细胞处理为单个细胞的过程中会造成细胞膜损伤，从而造成Annexin V假阳性。因此需要进行优化。可使用对细胞更温和的酶如 Accutase 处理贴壁细胞。

样本检测

  1. 按实验方案诱导凋亡。
  2. 用预冷PBS离心洗涤，收集1-10×105个细胞(包括培养上清中的细胞)。用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取500 μl 1×Binding Buffer重悬细胞。
  3. 每管加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI。
  4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。
  5. 上机检测分析。在流式细胞仪上，通过FITC检测通道检测 Annexin V-FITC (Ex = 488nm; Em = 530 nm)和通过PI检测通道(Ex = 535 nm; Em = 615 nm)检测 PI。