值得收藏的基础流式技术贴(一)

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流式细胞术作为一项生命科学领域的重要技术,想要使用好自然是不容易。相信不少小伙伴在使用几次之后,还是会有云里雾里的感觉。真正想掌握好一门技术,还是得从基础部分就做好。话不多说,直接上干货!

1 丨 如何搭配流式抗体荧光标记?

流式抗体荧光标记搭配主要由3个因素决定:流式细胞仪能检测多少个通道、需要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记。流式细胞仪的通道越多,那么同一份样本能同时检测的表面/胞内/核内蛋白就越多。

● 每个通道只能选择1 种荧光素

以Calibur为例说明:Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488,或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC;Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素,但是我们搭配的时候只能选择其中1个。

● 各个通道之间的荧光素可以随意搭配

如果流式细胞仪能做4个通道,在第1个原则之下,那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2根激光的Calibur为例,如常用的搭配是FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro488(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+APC(FL4), 或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PerCP(FL3)+AlexFluro647(FL4),或者FITC(FL1)+PE(FL2)+PE- Cy5(FL3)+APC(FL4)等多种组合。总之,在第1原则之下,我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是,APC和PE-Cy5一起使用的话,容易导致补偿过度,因此,通常我们不会将这两种荧光素一起使用,即使他们不在同一通道检测。

2 丨 如何根据流式细胞仪搭配流式抗体?

流式细胞仪能检测多少个通道是由仪器有多少根激光以及每根激光的功能决定的,所以首先需要注意两点:

● 流式细胞仪有哪些激光

比如,标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光,能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色,而选配的Calibur (FACSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光,可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。

● 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力不一样

比如Calibur的FL3(第3通道)能检测PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5,PE-Cy7,而FACSAria的第3 通道只能检测PE-Texas Red,PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色,但是第4个通道检测的荧光素是不一样的。

3 丨 如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道,怎么办?

如果需要做5个指标,而流式细胞仪只能做4个通道,首先将指标归成2类,再将样本分成2份,分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma,可以将样本分成两份,第1份加CD3、CD4、CD8 和IL-4,而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。具体的归类方式可根据课题的设计来进行。

4 丨 流式检测样本如何保存?

● 全血样本:一般来说,血液样本必须在6个小时内处理,最晚不得超过12小时;做完染色后,需要放在多聚甲醛中保存,一般可以存放3天左右。
● 培养细胞样本:培养的细胞可以用多聚甲醛保存。
● 做DNA倍体的样本:将样本保存在70%的乙醇中,并适量加入血清,-70℃冰箱保存,可以几个月内检测。

5 丨 抗体染色的细胞不能立即检测该如何处理?

如果实验对细胞活性要求比较高,如凋亡实验,必须尽快检测;
如果实验对细胞活性要求不高,可以使用含有4%多聚甲醛的PBS固定样本30分钟,固定后的细胞4℃过夜保存,次日检测。

6 丨 同型对照的作用是什么?

抗体有时会和非抗原结合,可能会因为非特异的蛋白-蛋白相互作用结合细胞内成分,因为疏水作用结合脂肪,也可能会结合一些细胞表面表达的抗体受体。比如,IgG亚型的抗体会结合细胞表面的Fc受体,如CD16、CD32和CD64。理想条件下,各种类型的非特异性结合都可以通过蛋白(BSA、牛奶或动物血清)来阻断。Fc受体的结合则可以通过与含免疫球蛋白的血清预孵育来阻断。一个抗体非特异性相互作用和受体结合的情况,可以用无关抗原的相同亚型抗体来比照。

7 丨 什么时候需要使用同型对照?

● 做胞内流式实验:比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。
● 表面标志特异性不高或者不常见的: 一些特异性不高的抗体,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性; 因为不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。
● 对流式非常熟悉,且检测的是CD3、CD4、CD19等表达强度非常高的标志,可以不使用同型对照。

8 丨 怎样选择同型对照?

● 一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体:
比如抗人的CD56 FITC标记的抗体,亚型是Mouse IgG1,κ,那么它的同型对照应该是FITC标记的Mouse IgG1,κ。
● 如果是抗体的组合形式,纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照:
比如CD86的纯化抗体,亚型是Mouse IgG1,κ,二抗是PE标记的抗小鼠IgG1,那么它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,κ。染色方式如下:样本管,纯化的CD86+PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本;同型对照管,纯化的同型对照+PE标记的抗Mouse IgG1(二抗)+样本。
● 如果没有找到适合的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,优先选择的顺序是亚链不同--亚型不同--相同类别:
比如,某抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里找不到完全相同的同型对照,那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型对照;如果也没有找到Mouse IgG2а,那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照;如果最后还是没有找到Mouse IgG2b,那么选择相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。

9 丨 为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高?

首先需要检查同型对照是否加错类型、剂量等。其次,因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照,如空白对照等。