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作者：池博 发布日期：2020-07-13 09:00
 细胞外囊泡（Extracellular vacules，EVs）是由细胞释放的纳米球形膜颗粒，它含有mRNA、miRNA、非编码RNA、蛋白质、脂类和DNA。EVs可由多种细胞分泌。例如免疫细胞中的树突状细胞（DC）、T细胞和B细胞等。这些球形膜小泡存在于各种生理液体中，如尿液、血浆、脑脊液、母乳，甚至渗出液。EVs参与了细胞间的相互作用，包括蛋白质和RNA的转移。 CD3+T细胞、CD4+T细胞、和CD8+T细胞都可分泌EVs。T细胞释放的EVs被认为可以传递抗原特异性信号，动脉粥样硬化信号，以及共刺激信号。其中活化的CD4+T细胞已被证明可释放表达CD3、CD4、CD25、T细胞受体（TCR）、淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）和Fas配体（FasL）的生物活性EVs，并参与DC介导的T细胞活化的免疫调节。 许多研究都集中在T细胞释放的EVs的免疫调节上，但少有研究探讨CD4+T细胞EVs在B细胞反应中的作用。本文实验表明，CD4+T细胞EVs显著促进B细胞活化、增殖和抗体生成。其中CD40L参与了T细胞EVs介导的B细胞反应。CD4+T细胞EVs以抗原依赖的方式促进HBsAg免疫小鼠产生HBsAb。 首先，作者通过检测GW4869处理CD4+T细胞后，细胞上清中蛋白浓度，EVs 标志分子CD63的浓度，证实了GW4869呈剂量依赖型地抑制CD4+T细胞的EVs分泌（下图A）。随后设计了巧妙的CD4+T细胞与B细胞的共培养体系，容许EVs扩散而阻止了两种细胞的直接接触（下图B）。在这个培养体系里，GW4869抑制CD4+T细胞分泌EVs，引起B细胞表面分子CD86，MHC Ⅱ含量以及上清中IgG含量的下降（下图C,D）。随后对CD4+T细胞体外激活培养后，采用磁珠法去除上清中CD63+EVs（下图E、F），检测了去除CD63+EVs的上清对B细胞的激活作用。同样也是检测了B细胞表面分子CD86，MHC Ⅱ，上清中IgG含量（下图G，H）。结果进一步证实了CD4+T细胞EVs对B细胞的刺激作用。 接下来，作者利用小鼠T淋巴瘤细胞系EL-4（该细胞系是体外研究T细胞与B细胞相互作用的良好模型）验证了上面的推测。 该文思路清晰，实验设计合理，严谨，每一步都设有合理的对照。值得我们学习。用到的主要技术方法有流式细胞术、ELISA、Western Blot等。其中用于检测IgG及亚型IgG2a，IgG1的ELISA试剂盒由我们公司提供。相关试剂盒如下：
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接下来，作者对来自于OVA免疫小鼠，HBsAg免疫小鼠和野生型小鼠的CD4+T细胞的EVs与HBsAg共免疫小鼠（下图A）。利用联科生物ELISA试剂盒检测了共免疫小鼠血清中IgG及其亚型含量。结果发现HBsAg预免疫小鼠来源的CD4+T细胞产生的EVs对B细胞特异性抗体的产生具有更强的刺激作用（下图B,C,D）。说明CD4+T细胞EVs的生物学功效有抗原特异性。而抗原特异的EVs主要是刺激Th1细胞产生抗体。
膜染料PKH26和PKH67染色的CD4+T细胞EVs，与B细胞共培养，随后检测发现EVs多数与B细胞结合（下图A），且可被B细胞内吞（下图B）。
对来自于野生型小鼠和OVA免疫小鼠的CD4+T细胞分别给予CD3/CD28刺激或不刺激的处理，所产生的EVs与B细胞孵育，通过流式细胞术检测B细胞表面分子含量。结果发现激活的CD4+T细胞释放的EVs才可诱导B细胞活化（下图A），并且呈剂量效应（下图B）。
OVA免疫鼠中提取的B细胞，用CFSE标志。与CD4+T细胞EVs孵育，检测B细胞增殖。结果发现来源于野生型小鼠和OVA免疫小鼠的CD4+T细胞的EVs对B细胞增殖都有促进作用，其中以OVA来源的效果更高（下图A）。对B细胞IgG的产生也有促进作用，且呈剂量效应（下图B）。所以CD4+T细胞来源的EVs对B细胞活化、增殖、抗体产生都有作用。抗原特异性EVs效果更好。
CD40L是一种在TCR刺激下活化的CD4+T细胞上表达的II型跨膜细胞因子。它与B细胞表面的CD40结合以产生依赖于T细胞的抗体反应。CD40L对于B细胞亲和力成熟、免疫球蛋白类别转换和长寿命浆细胞生成过程至关重要。检测到在CD3/CD28刺激的CD4+T细胞上观察到CD40L的高表达，而未加刺激的CD40L表达量低（下图）。基于这个现象，作者推测CD40L可能在CD+T细胞EVs介导的B细胞反应中起重要作用。
