ELISA通关必备(12)丨数据篇丨标准曲线不佳

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ELISA实验加入显色底物后,标准品有颜色,但结果分析发现标准品最高点吸光值偏低或偏高、标准曲线无梯度等等,总结如下原因:

 

标准曲线最高点吸光值偏高,超出仪器检测范围

ELISA标准曲线最高点的吸光值一般在3.0以下,若太高超出仪器检测范围,显示OVER FLOW,可能原因:

序号 可能原因 解决方法
1 如OD绝对值靠谱,则显色过度 TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断, 当S1,S2深蓝色,有明显梯度,S5有淡蓝色时即可终止。
2 仅作单波长检测 由于参考波长读取非特异性检测,如指纹、划痕、水渍等, 对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。

 

标准曲线最高点吸光值偏低

ELISA标准曲线最高点的吸光值一般要在0.8以上,若小于0.8,可能的原因:

序号 可能原因 解决方法
1 粉末标准品未充分溶解 粉末标准品按说明书加一定体积的液体后,轻柔混匀, 室温静置30分钟,充分溶解。
2 标准品反复冻融 标准品反复冻融后活性降低。
3 孵育温度、时间 按说明书要求孵育条件进行孵育。
4 显色时间控制 TMB显色体系中建议根据S1,S2颜色进行判断,当S1,S2深蓝色,有明显梯度,S5有淡蓝色时即可终止。

 

三、标准曲线无梯度

ELISA 实验中标准品2倍倍比稀释,但结果分析标准曲线没有梯度,可能的原因:

序号 可能原因 解决方法
1 样品或标准品污染 避免污染
2 错误的样品或标准品的稀释 完全按照说明书稀释
3 偶联抗体浓度过高 按照说明书调整到最佳的浓度
4 TMB底物孵育时间过长 调整到合适的孵育时间
5 错误的孵育时间或温度 完全按照说明书
6 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 贴封片或加盖

 

总结

得到完美ELISA标准曲线,需要注意几点:

1、 充分溶解标准品;

2、 标准品避免反复冻融;

3、 梯度稀释标准品注意混匀。