ELISA常见问题与对策

在确定ELISA试剂盒没有假冒伪劣情况下，使用干净容器配置缓冲液等，避免污染，特别注意水质，按照说明书操作。说明书中的操作步骤，包括时间，溶液配制和稀释方法，有些是可以变动的，有些是在开发过程中经过多次试验优化的，保险起见，尽可能地按照说明书操作。

1. 移液操作时，酶标板孔中要垂直悬空加入液体，避免加到孔壁上。
2. 实验前将所有试剂平衡至室温。
3. 标准品粉末溶解前需要先短暂离心，使管内标准品全部集中在管底。
4. 实验要做复孔，减少误差。
5. 振荡孵育，加强反应。
6. 每次洗板必须将洗液弃干净。
7. 酶标仪检测前预热，双波长检测。
8. 注意显色判断，适时终止。

大部分指标试剂盒是2-8℃保存。有个别指标中部分组分需-20℃保存，其他组分2-8℃保存，具体请参考相关产品说明书。

在使用 ELISA方法对血浆和血清进行定量时，偶尔会遇到基质效应所造成的问题。基质效应可能由多种基质组分引起，包括但不限于：内源性生物成分之间的相互作用，例如磷脂、碳水化合物和内源性代谢物（胆红素），或目标分析物与基质之间的相互作用，例如共价结合到血浆蛋白。这会导致错误的样品读值。可将样品稀释 2 - 5 倍降低基质效应。

高敏试剂盒是在普通试剂盒的原理基础上增加了信号放大系统，使可测率提高，更适用于低丰度蛋白的检测；在显色时间上，一般高敏的显色时间会比普通稍短些，建议显色2-3分钟的时候看一下标曲的显色状态，若已满足S1,S2,S3孔有明显梯度，S5孔有淡蓝色即可终止反应。

需要确认标准曲线是否复孔，样本是否复孔，预实验选择几个样本，做几个梯度。

• 单标单孔：不做预实验，96T可以做88个样本，48T可以做40个样本；
• 单标单孔：做4个样本两个梯度的预实验，96T可以做72个样本，48T需要另外购买一支标准品，可以做24个样本；
• 双标复孔：不做预实验，96T可以做40个样本，48T可以做16个样本；
• 双标复孔：做4个样本两个梯度的预实验（单标单孔），96T可以做32个样本，48T需要另外购买一支标准品，可以做8个样本；

单个指标，一般如下准备（下列均为单孔量）；若做复孔，需要2倍的量；做预实验，需要1.5倍的量。

• 血清、血浆>50uL/样；
• 细胞培养上清>100 uL /样（提供相应的培养基5ml/板）；
• 组织量>50mg/样。

联科ELISA试剂盒只有洗液，显色底物TMB和终止液可以共用，除此之外其他溶液均不能共用。

如果显色完成后，肉眼可见整版没有显示反应，则可能原因如下。

花板是指显色不均匀，有的孔莫名其妙颜色很深、有的忽高忽低、孔底斑驳有色块、复孔 OD 差距巨大。

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释，但标准曲线最高点OD值偏高或偏低，且没有梯度，可能原因及解决方法如下。当然，也会存在酶标版封闭不足，本底不稳定的情况。

标曲正常，但是样本读值极低，甚至有低于空白孔的情况。