流式细胞术中荧光补偿该如何调节?

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在讨论如何调节的问题前,我们先了解下流式实验为何需要调补偿?

荧光分子在被激发后都会发射特定波长范围的光,但是这些荧光的发射光之间会发生光谱重叠。

荧光补偿的调节是纠正荧光素发射光谱重叠的过程,即从一个被检测的荧光信号中减掉溢漏过来的其他光。

荧光发射光光谱重叠示例:

以FITC和PE为例来看光谱重叠。FITC单染管的荧光会部分漏到PE通道中,而这部分需要从PE通道中减掉溢漏过来的FITC荧光。

那么荧光补偿该如何调节呢?

  1. 调节电压
  2. 检测荧光通道的自发荧光
  3. 每个荧光通道做单染管对照检测

何为单染管对照?

  • 细胞
  • 补偿微球

细胞通常是流式抗体单染管对照的样本首选,但是当细胞数量有限,无多余细胞用于抗体单染或感兴趣的表面抗原表达较低,阳性分群不明显不足以用来调节补偿时,建议选择补偿微球。

补偿调节时要注意:

  • 使用未染色的细胞做PMT的电压设置
  • 不要使用未染色的补偿微球设置电压

eBioscience提供两种补偿微球:OneComp eBeads与UltraComp eBeads。

微球大小和淋巴细胞相当,可连接各种荧光标记的抗体来调节补偿。每滴微球中都含有两群:一群是可以结合抗体的阳性群,一群是不会与抗体反应的阴性群。

优点:

  • 使用方便,一滴即可
  • 使用实验抗体与微球有效结合调节补偿,无需再用CD4分群来调节
  • 细胞替代物,适应各种孵育时间,结果稳定
  • 能与各种种属和亚型的抗体反应
  • 竞争品牌的微球是分种属的,使用不同抗体要购买多个产品以使用
    注:兔来源的抗体与微球结合力较弱,但某些还是可以使用

  • 适用于各种激发光
  • 适用于488 nm 蓝光,532 nm 绿光,561 nm 黄光,633-635 nm 红光,UltraComp eBeads尤其适用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器

  • 微球本身信号经过优化适合补偿调节
  • 价格相当,有小包装

操作步骤:

  1. 准备好流式管,每种荧光抗体一个;
  2. 将微球翻转或者涡旋混匀;
  3. 在每管中加入一滴微球;
  4. 在管中分别加入相应的 1 test 抗体(不同抗体 1 Test 的用量不同,具体参见说明书);
  5. 敲击或者涡旋混匀;
  6. 2-8℃暗处孵育 15-30 分钟;
  7. 每管加 2mL 流式染色缓冲液,400-600 x g 离心 3-5 分钟;
  8. 弃上清,每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色缓冲液;
  9. 混匀后上机分析。

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