了解ELISA常见问题与对策，避开不必要的坑

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酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是蛋白定量金标准。其原理简单，样本制备简单，灵敏度高（pg/ml），特异性强，重复性好，操作简单，检测仪器易获得（酶标仪），是免疫学中的常规手段。

但是ELISA也是一个细节决定成败的实验。我们了解更多操作中的问题可以有效避免踩坑，使得能够达到事半功倍的效果，早日获得科研结果。

一、ELISA操作注意事项

在确定ELISA试剂盒没有假冒伪劣情况下，使用干净容器配置缓冲液等，避免污染，特别注意水质，按照说明书操作。说明书中的操作步骤，包括时间，溶液配制和稀释方法，有些是可以变动的，有些是在开发过程中经过多次试验优化的，保险起见，尽可能地按照说明书操作。

序号 注意事项
1 移液操作时，酶标板孔中要垂直悬空加入液体，避免加到孔壁上。
2 实验前将所有试剂平衡至室温。
3 标准品粉末溶解前需要先短暂离心，使管内标准品全部集中在管底。
4 实验要做复孔，减少误差。
5 振荡孵育，加强反应。
6 每次洗板必须将洗液弃干净。
7 酶标仪检测前预热，双波长检测。
8 注意显色判断，适时终止。

但是有时即使我们认为完全按照说明书操作的，仍然会出现诸多问题。下面按照问题类别逐一进行排查。

二、实验结果出现白板

如果显色完成后，肉眼可见整版没有显示反应，则可能原因如下。

序号 原因 对策
1 试剂盒储存不当，试剂失效。不同试剂盒试剂混用 购买新的试剂盒，注意储存条件。不可混用。
2 孵育温度低，时间短 如果温度偏低，则延长孵育时间和显色时间
3 错加、漏加试剂 严格按照说明书步骤添加正确试剂
4 用于配置溶液的容器不干净，或水有问题，比如含有抑制酶活的EDTA、叠氮化钠等 使用干净容器，合格的蒸馏水
5 检测抗体和/或HRP浓度太低 参照说明书，不可随意稀释
6 试剂温度不均一 所有试剂要室温平衡30 min
7 洗板过程中浸泡时间长，洗板次数太多，洗板冲击力大 按说明书操作

三、花板、背景高

花板是指酶标孔板显色不均匀，有的孔莫名其妙颜色很深、有的忽高忽低、孔底斑驳有色块、复孔 OD 差距巨大。

序号 原因 对策
1 洗涤次数少，不充分。 按说明书要求洗涤。
2 底物TMB被金属离子或氧化剂污染或曝光。 配置时使用干净容器，合格蒸馏水。避光保存。
3 孵育温度高和/或时间过长。 控制孵育和最后酶促反应的温度和时间。
4 加样时未更换枪头，造成交叉污染。 每个样都更换枪头。
5 附近孔交叉污染。 洗涤时，洗液不可溢出孔洞，垂直拍板，使用合适的拍板纸，避免孔内进入纸屑尘渣。孵育时封板要严密，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。
6 样本存在内源性干扰物质 推测可能的感染物质，给予相应的处理
7 样本溶血、贮存过久、凝集不全、被细菌污染、采血管中添加物影响。 避免溶血、污染、过久储存等现象。

四、标曲不佳

ELISA 实验中标准品进行了倍比稀释，但标准曲线最高点OD值偏高或偏低，且没有梯度，可能原因及解决方法如下。当然，也会存在酶标版封闭不足，本底不稳定的情况。

结果 可能原因 解决方法
标曲最高点OD太高(>3.0) TMB孵育时间太长 调整孵育时间
指纹，杂质影响 双波长检测，去背景
标曲最高点OD正常 标准品进行下一步稀释前，没有混匀 先混匀，再移液
不同试剂盒或不同批号的试剂混用 不能混用
检测抗体浓度过高 按照说明书调整到最佳浓度
孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 贴封片或加盖
孔间污染 加样及洗板时防止孔间污染
标曲最高点OD偏低(<0.8) 显色时间不够 S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时可终止。
粉末标准品未充分溶解 粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，轻柔混匀，室温静置30分钟，充分溶解。
标准品反复冻融 标准品反复冻融后活性降低。购置新的标准品。
孵育温度、时间 所有试剂室温（~25℃）平衡30 min，孵育时间按照说明书指示。
洗涤浸泡时间过长 按照说明书操作，勿人为增加浸泡时间。
酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥 防止板过于干燥。
不同试剂盒或不同批号的试剂混用 不能混用
显色液变质 更换新的显色液

五、标曲正常，样本吸光值极低

标曲正常，但是样本读值极低，甚至有低于空白孔的情况。

序号 原因 对策
1 样品不适合做ELISA检测 样品一般选择培养上清、血清、血浆。 其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）。
2 样本含量低于灵敏度 尝试浓缩样本或使用高敏试剂盒，避免反复冻融
3 样本存于吸附性强的试管中，导致蛋白含量下降 选择蛋白吸附能力低的硅化EP管
4 冻融后，蛋白凝集，分布不均 混匀，避免产生气泡
5 样本反复冻融，导致抗原滴度下降 样本避免反复冻融

此外，如果肉眼观察酶标版显色正常，而上机所测OD异常，检测酶标仪参数的设定，滤光片是否匹配。洗涤液多为非离子型中性缓冲液，既含有亲水集团，也含有疏水基团。可以使吸附在酶标版上的蛋白解离而溶于水中，去除非特异性吸附。但是浓度太高时，会引起包被抗体脱落。所以需要正确稀释。同时应该用高质量的纯净水稀释，不能引入别的离子，以免对抗原抗体结合和酶促反应产生影响。

在实验过程中，我们往往觉得自己已经注意了所有细节，实验结果仍然有可能出乎意料。以上总结了常见问题及对策。联科生物提供高品质的产品，有普通、高敏和一步法三款产品供选择，价格亲民，欢迎垂询。