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技术分享 | 细胞毒性检测方法

作者:佚名    发布日期:2019-04-02 09:00

 

MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

常用实验步骤:


1.接种细胞:用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔合适的细胞数量接种到96孔板,每孔体积180ul;

2.培养细胞:同一般培养条件,可根据试验目的和要求决定培养时间;

3.呈色:每孔加MTT溶液(5 mg/ml用PBS缓冲液pH=7.4配制)20ul。继续孵育4小时,终止培养,小心弃去孔内培养上清液,对于悬浮细胞,需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

联科生物MTT试剂盒提供MTT Solvent,可直接添加溶解MTT。试剂盒中还包含Formazan Solvent,使用中若是悬浮细胞,可直接在培养基中加入与初始体积等量的溶解液。

4.比色:选择 490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。

 

影响实验关键因素:

 

1. 细胞消化。若消化出现问题,则会影响细胞的活性,进而影响OD值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加EDTA,消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。然而,对于SW480等一系列难以消化的细胞,胰蛋白酶中需添加浓度为0.25%的EDTA;
2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜,过小或过大均会影响OD值(过小细胞容易死亡,过大细胞容易生长拥挤);
3. 培养液的弃去。或用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。或将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。
4. 结晶物的溶解。加入DMSO,放入37℃孵箱内孵育10~20 min,有助于DMSO对紫色结晶物的溶解。

困惑:
弃液,细胞脱落或培养液里的紫色结晶易吸去,重复性差,怎么办?

建议先用平板离心机离心96孔板,之后参考以下推荐方法:

方法1:用1mL医用的注射器加上针头吸取液体,吸取时要把板子斜放,沿着壁吸取。

方法2:优化操作,使用三联溶解液:10%SDS,5%异丁醇,0.012 mol/LHCL,蒸馏水溶解。

文献:评价抗癌物质活性的改良MTT方法.周建军.中国医药工业杂志,1993,24(10):455-457.

方法3:使用MTSblue。MTSblue的活性成份是Resazurin,一种无毒、可透膜的蓝色染料,有微弱的荧光性。联科生物MTSblue采用单一试剂,只需加入培养基即可连续、快速地检测细胞的增殖状况。相比于MTT,无毒、即用、可连续检测,值得推荐。

方法4:使用CCK-8试剂,它利用有高度水溶性的黄色甲染料,且CCK-8试剂组分单一,无需其它组分预混等操作。相比MTT,CCK-8:

1、操作简便,只需一步即可得到结果;

2、省时即开即用,无需配置其它溶液;

3、安全,无需放射性同位素和有机溶剂;

4、快速,省去了溶解沉淀等操作;

5、重现性好,步骤少、损失少。

MTSblue检测BHK21 细胞:


联科生物提供不同规格MTT、MTSblue 、CCK8试剂供实验选择。有需求的同学,请联系联科生物当地销售。

 

产品列表:

 
  存货编码
  存货名称
  规格型号
  目录价
  100assays
  150
  200assays
  200
  500assays
  300
  1000assays
  500
  100 T
  90
  500 T
  300
  1000 T
  600
  10000 T
  2000
  100T
  200
  200T
  360
  500T
  600
  1000T
  1000
  3000T
  2400
  10000T
  6000


以上文章参考丁香园

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