技术分享 | 细胞毒性检测方法

MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

常用实验步骤：

1.接种细胞：用含10%胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔合适的细胞数量接种到96孔板，每孔体积180ul；

2.培养细胞：同一般培养条件，可根据试验目的和要求决定培养时间；

3.呈色：每孔加MTT溶液（5 mg/ml用PBS缓冲液pH=7.4配制）20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，对于悬浮细胞，需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

联科生物MTT试剂盒提供MTT Solvent，可直接添加溶解MTT。试剂盒中还包含Formazan Solvent，使用中若是悬浮细胞，可直接在培养基中加入与初始体积等量的溶解液。

4.比色：选择 490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

影响实验关键因素：

1. 细胞消化。若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响OD值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞，消化时胰蛋白酶中不添加EDTA，消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。然而，对于SW480等一系列难以消化的细胞，胰蛋白酶中需添加浓度为0.25%的EDTA；2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜，过小或过大均会影响OD值（过小细胞容易死亡，过大细胞容易生长拥挤）；3. 培养液的弃去。或用移液器吸取孔内培养液，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶。或将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。4. 结晶物的溶解。加入DMSO，放入37℃孵箱内孵育10～20 min，有助于DMSO对紫色结晶物的溶解。

困惑：弃液，细胞脱落或培养液里的紫色结晶易吸去，重复性差，怎么办？

建议先用平板离心机离心96孔板，之后参考以下推荐方法：

方法1：用1mL医用的注射器加上针头吸取液体，吸取时要把板子斜放，沿着壁吸取。

方法2：优化操作，使用三联溶解液：10%SDS，5%异丁醇，0.012 mol/LHCL，蒸馏水溶解。

文献：评价抗癌物质活性的改良MTT方法.周建军.中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457.

方法3：使用MTSblue。MTSblue的活性成份是Resazurin，一种无毒、可透膜的蓝色染料，有微弱的荧光性。联科生物MTSblue采用单一试剂，只需加入培养基即可连续、快速地检测细胞的增殖状况。相比于MTT，无毒、即用、可连续检测，值得推荐。

方法4：使用CCK-8试剂，它利用有高度水溶性的黄色甲染料，且CCK-8试剂组分单一，无需其它组分预混等操作。相比MTT，CCK-8：

1、操作简便，只需一步即可得到结果；

2、省时即开即用，无需配置其它溶液；

3、安全，无需放射性同位素和有机溶剂；

4、快速，省去了溶解沉淀等操作；

5、重现性好，步骤少、损失少。

MTSblue检测BHK21 细胞：

联科生物提供不同规格MTT、MTSblue 、CCK8试剂供实验选择。有需求的同学，请联系联科生物当地销售。

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以上文章参考丁香园