流式胞内染色做不出阳性?从刺激、阻断到打孔逐条排查
做流式胞内因子或磷酸化蛋白时,最让人崩溃的不是没有图,而是样本处理了、抗体也加了,阳性群却始终出不来。与其反复怀疑抗体,不如按流程逐条排查。 第一步:先看刺激是否到位 很多胞内因子并不是“随时都有”。未刺激的淋巴细胞通常处于静息状态,IFN-γ、TNF-α、IL-2 等因子表达很低,直接染色自然看不到阳性。 如果是检测分泌型细胞因子,通常需要合适的刺激条件;如果是磷酸化蛋白,刺激时间往往更短,信号…
做流式胞内因子或磷酸化蛋白时,最让人崩溃的不是没有图,而是样本处理了、抗体也加了,阳性群却始终出不来。与其反复怀疑抗体,不如按流程逐条排查。 第一步:先看刺激是否到位 很多胞内因子并不是“随时都有”。未刺激的淋巴细胞通常处于静息状态,IFN-γ、TNF-α、IL-2 等因子表达很低,直接染色自然看不到阳性。 如果是检测分泌型细胞因子,通常需要合适的刺激条件;如果是磷酸化蛋白,刺激时间往往更短,信号…
做ELISA时,很多人会盯着450 nm读数看:0.8是不是比0.4高一倍?浓度是不是也高一倍? 其实,OD值本身不能直接代表浓度。ELISA之所以能报出pg/mL、ng/mL,靠的是标准曲线、拟合模型和检测限体系共同支撑。 一、ELISA定量的底层逻辑 ELISA的信号来自抗原抗体结合后的酶促显色反应。目标分子越多,结合的酶越多,显色越强,OD值越高。 但这个关系并不是简单的直线。低浓度区信号增…
多色流式最容易翻车的地方,往往不是抗体买不到,而是配色一开始就没排好。等上机后才发现补偿难调、弱阳性分不开、共表达群被拉偏,再想补救就很被动。更稳的做法是:先定主群,再排荧光溢出。 第一步:先把要圈哪些细胞写清楚 配色前别急着挑荧光。先明确实验目的:你要分析外周血 T 细胞亚群,还是肿瘤微环境免疫细胞?主群标记通常包括活死染料、CD45、CD3、CD4、CD8 等,它们决定了整条设门路径。 主群圈…
为期四天的第十八届全国免疫学学术大会已于长沙国际会议中心圆满落幕。本次大会是国内免疫学领域顶级学术盛会,汇聚全国科研学者、临床及产业同仁,共探免疫前沿。联科生物携全套免疫研究解决方案亮相 C16 展位,与各位老师面对面交流,收获满满。 展会期间,联科重点展示ELISA 试剂盒、流式抗体、凋亡试剂盒、周期试剂盒、Th/Treg试剂盒、CBA 多因子检测试剂盒等成熟产品。展台咨询络绎不绝,众多老师前来…
做免疫、炎症、肿瘤方向的同学,经常会遇到一个问题: 我想测 IL-6、TNF-α、IFN-γ 这些细胞因子,到底用 ELISA 还是流式? 其实不是“谁更好”,而是你想回答什么问题。 ELISA 更适合回答:样本里到底有多少? ELISA 测的是浓度,比如 pg/mL、ng/mL。 它适合看血清、血浆、细胞上清、组织匀浆里细胞因子的整体水平。 优点是灵敏度高、操作相对标准、结果直观,容易放进论文的…
做实验最怕的不是结果阴性,而是方法选错了。 同一个目标蛋白,你可以用流式看单细胞表达,用WB看分子量,用ELISA定量浓度,用免疫组化看组织定位。方法都对,但回答的问题完全不同。 选错方法,可能忙活两周,最后发现数据回答不了你的科学问题。 一张表看懂四种方法 方法回答的问题样本类型定量能力通量流式细胞术哪些细胞表达?表达比例和强度如何?单细胞悬液半定量,适合比较相对表达高通量,单细胞水平Weste…
ELISA结果不稳,很多时候不是试剂问题,而是实验设计没排好。复孔太少、对照缺失、稀释梯度乱、质控点缺位,都会让数据很难解释。 开板前对照这份清单,能少踩很多坑。 1. 对照设置:先保证“这板能信” 对照可以分为必须设置和条件允许时设置两类。 必须设置的对照: 空白对照:只加样本稀释液或试剂盒稀释液,不加任何样本和标准品,按完整流程走一遍。读数后用它做背景扣除。 标准曲线:按说明书梯度稀释标准品,…
第一次做ELISA,最容易产生的疑问是:我到底在测什么?是测颜色深浅?测OD值?还是测某个蛋白的浓度? 准确地说,ELISA测的是样品中目标分子的量。颜色只是信号,OD值只是读数,最终要得到的是样品中抗原或抗体的浓度。 ELISA的核心:抗原抗体特异性识别 ELISA的基础是抗原与抗体的特异性结合。可以把抗体想象成一把“分子钥匙”,只能识别并结合对应的抗原目标。 常见检测对象包括: 细胞因子,如I…