第一部分：CIK（Cytokine Induced Killer）【背景知识】
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。
CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。
CIK细胞优势：杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
【培养原理】
CIK培养用细胞因子和抗体:
1. CD3激发型单抗：
T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成 TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或 CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或 MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。
由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致 T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起 T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的 CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的 T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的 T细胞均能被激活。
2. IL-2 (白细胞介素-2)
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。
此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。
3. IFN-γ(干扰素-γ)
IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-γ，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
4. IL-1α(白细胞介素-1α)
IL-1α也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1α与IFN-γ和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。
【细胞制备】
1．外周血单个核细胞的采集
⇒ 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞50-100mL；
⇒ 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
⇒ 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC。
2．CIK细胞的培养及鉴定
⇒ 将PBMC按1-2x 106/ml的浓度悬浮于无血清培养液中，加入1,000 U/ml的重组人IFN-γ，37oC，5%CO2培养箱中培养；
⇒ 24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1α。
⇒ 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
⇒ 在培养的第14d，收获CIK细胞。
⇒ CIK细胞质控：
♦ 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
♦ 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
♦ 细胞杀伤实验：以CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1 x 104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
♦ 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
【步骤简图】
【推荐试剂】
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 使用浓度 |
| eBioscience | Anti-Human CD3 Functional Grade Purified | 16-0037-85 | 500μg | / |
| PeproTech- biogems | Anti-Human CD3 SAFIRE Purified | 05121-25 | 100μg/500μg | / |
| PeproTech | 重组人IFN-γ (Animal Free) | AF-300-02 | 100μg/250μg/500μg/1mg | 50ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-1α (Animal Free) | AF-200-01A | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 0.1ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-2 (Animal Free) | AF-200-02 | 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 30ng/ml |
注：Animal Free意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 |
| PeproTech | 重组人Flt-3 Ligand (Animal Free) | AF-300-19 | 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg |
| PeproTech | 重组人IL-7 (Animal Free) | AF-200-07 | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg |
| PeproTech | 重组人IL-15 (Animal Free) | AF-200-15 | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg |
| PeproTech | 重组人SCF (Animal Free) | AF-300-07 | 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg |
【参考文献】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133
第二部分：DC-CIK【背景知识】
DC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。
DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指与DC细胞共培养的CIK细胞，也可以说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。
CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分，两者联合可确保高效的免疫反应。
【培养原理】
1．DC培养用细胞因子：
⇒ GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)
♦ GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。
♦ GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
⇒ IL-4 (白细胞介素-4)
♦ IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。
♦ GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表达CD14。
⇒ TNF-α (肿瘤坏死因子-α)
♦ TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
2. CIK培养用细胞因子和抗体（同上)
【细胞制备】
1．外周血单个核细胞的采集
⇒ 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80-100mL；
⇒ 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)；
⇒ 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的 PBMC，细胞数量需达到1-3x108。
2．(可选步骤) 肿瘤抗原的制备
用于负载 DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。
用TSA或 TAA负载的DC具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。而用肿瘤全细胞抗原负载DC可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。
肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。
反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
⇒ 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
⇒ 无菌生理盐水洗3次；
⇒ 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；
⇒ 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
⇒ 用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；
⇒ 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。
反复 3-5 次；
注：也可以-80℃/37℃ 反复冻融3-5次。
⇒ 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
⇒ 收取上清，0.22μm 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
⇒ -80oC保存备用。
3. CIK 细胞的培养及鉴定
⇒ 步骤1中获得的PBMC用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
⇒ 37℃，5%CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
⇒ 收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至 1-2 x 106/ml；
⇒ 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-γ培养；
⇒ 24h 后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和300 U/ml的重组人IL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；
注：此时也可同时加入100 U/ml的重组人IL-1。
⇒ 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；
⇒ 在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x109个以上。
⇒ CIK细胞质控：
♦ 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
♦ 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。
4．DC 细胞的培养及鉴定
⇒ 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是 CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；
⇒ 每3d半量换液一次，并补足细胞因子；
⇒ (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50μg/ml，对DC进行抗原负载；
注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。
⇒ 在培养的第6d，加入重组人TNF-γ(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；
⇒ 在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；
⇒ DC的质检：
♦ 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；
♦ 流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC 是否成熟。
5. DC-CIK 细胞的制备和质检
⇒ 收集步骤4和步骤3中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1:10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2 (300 U/ml)；
⇒ 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)；
⇒ 在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
⇒ DC-CIK细胞的质检：
♦ 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
♦ 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%以上。
♦ 细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
♦ 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
【步骤简图】
【推荐试剂】
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 使用浓度 |
| eBioscience | Anti-Human CD3 Functional Grade Purified | 16-0037-85 | 500μg | / |
| PeproTech- biogems | Anti-Human CD3 SAFIRE Purified | 05121-25 | 100μg/500μg | / |
| PeproTech | 重组人 GM-CSF (Animal Free) | AF-300-03 | 20μg/50μg/100μg/ 250μg/500μg/1mg | 50-100ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IFN-γ (Animal Free) | AF-300-02 | 100μg/250μg/500μg/1mg | 50ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL-1α (Animal Free) | AF-200-01A | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 0.1ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL-2 (Animal Free) | AF-200-02 | 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 30ng/ml |
| PeproTech | 重组人 IL-4 (Animal Free) | AF-200-0 | 20μg/50μg/100μg/ 250μg/500μg/1mg | 100ng/ml |
注：Animal Free 意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病原体(如疯牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子
【其它相关试剂】
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 |
| PeproTech | 重组人 Flt-3 Ligand (Animal Free) | AF-300-19 | 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg |
| PeproTech | 重组人 IL-7 (Animal Free) | AF-200-07 | 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg |
| PeproTech | 重组人 IL-15 (Animal Free) | AF-200-15 | 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg |
| PeproTech | 重组人 SCF (Animal Free) | AF-300-07 | 10μg /50μg /100μg /250μg /500μg /1mg |
【参考文献】
[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution". J. Exp. Med. 1973; 137 (5):1142–62.
第三部分：CIK/DC在细胞治疗中的应用一、高效CIK
高效CIK（High-efficiency cytokine-induced killer），即高效细胞因子诱导的杀伤细胞，是治疗肿瘤和慢性传染性病毒感染的细胞免疫治疗方法之一。其技术是从患者自体外周血（20～100ml）中分离单个核细胞，经过体外刺激扩增培养，使在生理条件下具有杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤性效应的细胞亚群，主要是CD8＋杀伤性T淋巴细胞（CTL，约70%）和自然杀伤细胞（NK，约10%）得到大量的扩增和活化，之后经一次或多次回输给患者。高效CIK作为细胞过继性免疫治疗方法，可有效辅助恶性肿瘤和慢性传染性病毒感染的治疗。
1. 高效CIK治疗适应症
⇒ 确诊为恶性肿瘤或EBV、CMV、HPV、HBV、HCV病毒感染；
⇒ 预期生存期＞3个月的患者；
⇒ 实验室检查必须符合下列条件：淋巴细胞绝对值＞0.8×109/L；
⇒ 病人有自知能力，能签署知情或志愿同意书；
⇒ 患者依从性较好，能配合针对毒副反应的治疗；
⇒ 抗HIV（－），TPHA（－）；
2. 高效CIK治疗禁忌症
⇒ 合并颅内高压或意识不清的颅脑肿瘤；
⇒ 症状性心衰或严重心律失常；
⇒ 弥漫性血管性内凝血；
⇒ 血清肌酐和/或尿素氮≥正常值的1.5倍；
⇒ 败血症或其他难以控制的感染；
⇒ 肠梗阻；
⇒ 经治疗后心脏病情仍不稳定，入组前1个月内出现过心肌梗塞；
⇒ 有症状的周围神经病变＞2级（NCIC-CTG标准）；
⇒ 不可控制的糖尿病；
⇒ 严重精神紊乱；
⇒ 双磷酸盐难以控制的高钙血症，血钙浓度＞12mg/100ml；
⇒ 妊娠及哺乳期妇女；
⇒ 合并传染性疾病：艾滋病、梅毒等；
⇒ T淋巴细胞相关性淋巴瘤和白血病患者；
⇒ 有严重的T淋巴细胞相关自身免疫病的患者；
⇒ 因感染引起的发热患者；
3. 高效CIK的治疗方案
（一）单独使用
| 适用人群 | 预期效果 | 使用方案 |
| 手术后无其他治疗患者 | 预防复发和转移 | •第一阶段每周1次回输，共4-6次回输； •第二阶段每2周1次回输，共4-6次回输； •此后可每3个月至半年进行每周1次×4次回输； |
| 所有其他治疗无效肿瘤持续进展的患者 | 改善生活质量稳定肿瘤 | •1周1次回输，共6-8次回输后评价疗效； •如患者要求， 根据病情进展可持续进行每1-2周1次的回输； |
| 化疗或放疗有效但已停用， 需维持治疗效果的患者 | 长期维持肿瘤稳定 | •患者无肿瘤 o同手术后无其他治疗患者方案； •患者体内仍有肿瘤 o第一阶段每周1次回输，共4-6次回输； o第二阶段每2周1次回输，共4次回输； o根据患者的要求，可长期进行每2周1次的回； |
（二）与化疗联合使用
| 适用人群 | 预期效果 | 使用方案 |
| 正在进行化疗（静脉给药） 的患者（口服化疗药同单独 使用高效CIK治疗方案） | 改善生活质量，消除化疗副作用， 与化疗产生协同作用， 杀伤肿瘤细胞维持肿瘤稳定。 | •三周化疗方案 o化疗静脉给药结束后48小时回输、第9天回输； o自第一天给与化疗计算，第7天、第14天回输； •四周化疗方案 o化疗第7天和第17天各回输1次； •8天化疗，三周方案 o化疗第3天、第10天回输； |
（三）与靶向治疗联合使用
| 适用人群 | 预期效果 | 使用方案 |
| 正在进行靶向治疗的患者 | 通过ADCC作用与抗体类靶向治疗产生 协同作用，杀伤肿瘤改善靶向药物引 起的副作用维持肿瘤稳定。 | •根据靶向药物的治疗方案而定 o细胞回输通常在每次靶向药物给药后48小时； o靶向治疗结束后高效CIK治疗方案参考单独使用方案； |
4. 高效CIK血标本采集护理
⇒ 采血前做好患者的评估，包括病情、意识状态、生命体征、正在进行的治疗、静脉充盈情况、患者的理解及合作能力；
⇒ 两人核对患者的床号、姓名、住院号、采血时间、采血量等；
⇒ 告诉患者采血的目的和方法，让患者放松情绪，避免紧张；
⇒ 采血时协助患者取平卧位或坐位，暴露静脉，选择粗、直、大静脉，严格无菌操作采集血标本；
⇒ 采血过程中注意观察患者面色、神志，询问患者有无头晕、心慌等不适，如患者有头晕、乏力、心悸不适等情况即停止采血，报告医生，协助处理，采血完成按压穿刺点10min；
⇒ 将盛装血标本试管轻柔180°颠倒摇匀5～8次，以达到更好的抗凝效果，然后将血标本装于密封袋，贴上封条，存放于血样箱（温度4～8℃）立即送细胞实验室进行培养；
⇒ 填写细胞培养血标本采集护理记录单。
5. 高效CIK血样本采集注意事项
⇒ 采血前，患者可以饮温开水、低脂清淡饮食；
⇒ 采血前，不可以进行任何输液治疗；
⇒ 采血前1天，患者不可以进行可能损伤、破坏淋巴细胞的治疗和检查项目，如放疗、化疗、核医学检查等；
⇒ 连续两个疗程治疗时，取血和回输细胞在时间上会有交叉，取血必须在细胞回输之前；
⇒ 3天内的血常规，要求白细胞在正常范围，淋巴细胞绝对值大于0.8×109/L；
⇒ 采血量取决于患者淋巴细胞绝对数，采血量ml×淋巴细胞计数>0.8×109/L，约为20-100ml；
⇒ 如需冻存细胞，采血量需要增加；
⇒ 血标本采集后，置入4～8℃无菌运转箱由专人及时送至实验室，一般标本放置时间不能超过4h。
6.高效CIK回输护理
⇒ 心理护理，如客观讲解CIK的疗效及可能出现的副作用，消除患者及家属的疑惑和恐惧心理，取得配合。细胞治疗作为一种新疗法给肿瘤患者带来希望，但其疗效存在个体差异，应让患者和家属充分知情，可避免患者因不能达到预期的疗效而出现心理落差；
⇒ 确定回输时间，通知患者，根据治疗需要合理安排回输工作；
⇒ CIK细胞送到病房，护士应与实验员核对病人姓名、住院号、CIK编号、制备日期、回输日期、包装是否完整、细胞质量检测结果等；
⇒ 经外周静脉给患者回输，严格无菌操作，注意调节滴速，先慢后快；同时注意密切观察患者的一般情况，如体温、脉搏、呼吸、血压等，输注细胞前后均使用生理盐水冲管；
⇒ 输注过程中，密切巡视，5～10min轻轻挤压传输袋底部，使沉淀细胞重新悬浮，以免细胞沉淀聚集；
⇒ 副作用的观察及护理
♦ 发热，CIK最常见副作用为发热，常在回输后1-2h内发生，也有病人在回输4h之后发生发热反应。发生发热反应首先向医生汇报。一般情况，低、中度发热时可不作特殊处理，嘱患者多饮水；高热时按医嘱冰敷等物理降温或口服退热药物；患者寒战时注意观察病情变化，做好保暖，必要时给予吸氧；
♦ 变态反应，患者出现皮疹、呼吸困难、心悸等反应，临床上极少见此类反应，若出现变态反应立即停止输注，通知医生，给予吸氧、抗过敏处理；
⇒ 回输完毕，嘱门诊病人常规留观30min, 如有不适及时告知护士；嘱患者离院后如有病情变化，及时复诊；
⇒ 观察记录病人情况，填写细胞回输护理记录单。
7. 高效CIK回输注意事项
⇒ 输注细胞前必须经过两人核对无误，方可输入；
⇒ 认真检查细胞质量，查看细胞检测报告；
⇒ 使用一次性输血管，禁止使用带精密过滤器的输液管；使用7号或以上的头皮针，避免小针头产生的剪切力对细胞的损害；
⇒ 禁止在细胞内加入其它药物；
⇒ 注意输注速度，起始速度30～40滴/min，观察10min后如没有特殊反应，将滴速改为60～80滴/min，40～60分钟内输完；
⇒ 细胞培养后要及时回输，需要保存时必须放冰箱2～8℃保存不超过8h；
⇒ 放疗、化疗前后需间隔48小时以上方可进行细胞回输，防止放疗、化疗杀伤CIK细胞，影响疗效。
二、DC-CIK
随着细胞制备技术的日趋完善，DC-CIK细胞过继免疫治疗在临床逐渐开展，相关报道可见。实验研究方面，Marten实验研究表明：DC和CIK共培养可以同时促进CIK细胞和DC细胞的增殖和免疫功能。张嵩等的动物实验研究表明：化疗后应用DC-CIK细胞可有效抑制肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤完全消失；而且DC-CIK细胞的抗肿瘤效应对集体免疫系统功能不产生危害，在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，应用DC-CIK细胞作为肿瘤放化疗和手术后的辅助治疗有重要的临床意义。
1. 在白血病中的应用
赵春华等研究表明：与DC共培养可使CIK细胞获得更高的增殖速率和更强的体内外抗肿瘤活性，DC-CIK细胞可以作为一种临床有效的抗白血病免疫治疗策略。童春容等临床研究显示：DC-CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞防止复发的作用，并且静脉输注安全。
2. 在肿瘤中的应用
将CIK细胞和同源DC细胞共培养后即可获得DC-CIK细胞。它既可促进DC细胞的成熟，更能促进ClK的增殖，并加强其抗肿瘤活性。DC细胞是机体免疫应答的始动者，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应；CIK细胞可通过非特异性免疫杀伤作用清除肿瘤患者体内微小残余病灶，所以负载肿瘤抗原的DC与CIK的有机结合（即DC-CIK细胞）能产生特异性和非特异性的双重抗肿瘤效应。
三、DC治疗对肿瘤治疗的原理
⇒ DC可以高表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，MHC分子与其捕获加工的肿瘤抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，并递呈给T细胞，从而启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4+ Thl反应。同时，DC还通过其高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，启动了免疫应答。
⇒ DC与T细胞结合可大量分泌IL-12、IL-18激活T细胞增殖，诱导CTL生成，主导Th1型免疫应答，利于肿瘤清除；激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用；
⇒ DC分泌趋化因子(Chemotactic Cytokines， CCK)专一趋化初始型T细胞促进T细胞聚集，增强了T细胞的激发。保持效应T细胞在肿瘤部位长期存在，可能通过释放某些抗血管生成物质(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影响肿瘤血管的形成。上述CCK进一步以正反馈旁分泌的方式活化DC，上调IL-12及CD80、CD86的表达；同时DC也直接向CD8+T细胞呈递抗原肽，在活化的CD4+ T细胞辅助下使CD8+ T细胞活化，CD4+和CD8+T细胞还可以进一步通过分泌细胞因子或直接杀伤，增强机体抗肿瘤免疫应答。
四、ACTL
全称“ AAV-DC-CTL靶向性抗肿瘤细胞免疫技术”，简称“ACTL™”或“ACTL技术”或“ACTL肿瘤细胞靶向治疗”。"ACTL™ Anti-Cancer Cellular Immunotherapy"
1. ACTL技术背景
2011年10月3日，加拿大科学家、美国医学会和美国国家科学院院士拉尔夫•斯坦曼（Steinman）教授获得2011年诺贝尔医学奖。斯坦曼获奖的原因在于他在“树突状细胞（Dendritic Cell, DC细胞）及其在适应性免疫系统方面作用的发现”。21世纪初，美国斯坦福大学医学院肿瘤中心刘勇教授在斯坦曼教授的指引下将其研究的以重组腺相关病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)与斯坦曼教授研究的DC细胞相结合，研发以携带某种或数种特定肿瘤相关抗原决定簇基因的重组腺相关病毒转染DC细胞，在体外刺激患者T淋巴细胞，产生特异性杀伤某种或数种肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic Lymphocyte, CTL细胞），随后进行相关的临床试验研究，获得成功。此治疗技术称为ACTL肿瘤细胞靶向治疗技术，已获得5项国际专利保护，由此技术制备的特异性杀伤肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞称为特异杀伤性T细胞（ACTL，A代表特异性抗原）具有高效性、靶向性（即特异性）杀伤某种或数种特定肿瘤相关抗原阳性肿瘤细胞以及PSMA 阳性的肿瘤新生血管内皮细胞的强大功能，对正常细胞无损伤作用。
ACTL肿瘤细胞靶向治疗技术临床应用的典型例子为斯坦曼教授自身晚期胰腺癌的治疗和苹果公司乔布斯晚期胰腺癌的治疗。拉尔夫•斯坦曼（Steinman）教授仅采用了此治疗技术，生存时间为4年。
在斯坦福大学肿瘤中心，经过数年的临床研究，于2010年证明了ACTL特异杀伤性T细胞不仅能够直接靶向杀伤肿瘤细胞，而且可封闭肿瘤新生血管，发挥间接杀伤肿瘤细胞作用，明显提升临床疗效。此项研究成果被2010年美国肿瘤临床学会(ASCO)评为2010年度上半年肿瘤生物治疗领域最重要的突破。
在美国进行的临床研究表明，ACTL特异杀伤性T细胞不仅有可能逆转妇科和前列腺等恶性肿瘤对抗激素治疗产生的耐药性，而且有可能逆转肿瘤细胞对易瑞沙、阿瓦斯丁等分子靶向药物治疗的耐药性。
2. ACTL技术治疗机理
AAV-DC-CTL™肿瘤细胞靶向治疗技术是将无致病性的野生型腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV) 通过基因重组技术改建为携带特定肿瘤相关抗原决定簇基因的重组腺相关病毒，感染患者的外周血单核细胞 (Monocytes. Mo)，经细胞因子诱导，单核细胞转化为具有强大抗原提呈功能的DC细胞。经此技术获得的DC细胞在体外刺激患者的T淋巴细胞，产生有效杀伤肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicT lymphocytes, CTL)。所产生的CTL 具有肿瘤抗原特异性，即靶向性，仅针对某种或数种特定肿瘤相关抗原阳性的肿瘤细胞以及PSMA 阳性的肿瘤新生血管内皮细胞具有杀伤作用，对抗原阴性的细胞无任何作用。
CTL细胞是CD8+的T细胞亚群，为一种特异T细胞，对某些病毒、肿瘤细胞等具有直接杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤的重要防线。CTL杀伤机制有：
①释放穿孔素，颗粒酶，裂解靶细胞。
②通过FasL介导靶细胞的凋亡。
推荐产品及相关产品汇总表：
一、CIK
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 使用浓度 |
| 推荐产品 | ||||
| eBioscience | Anti-Human CD3 Functional Grade Purified | 16-0037-85 | 500μg | |
| PeproTech- biogems | Anti-Human CD3 SAFIRE Purified | 05121-25 | 100μg/500μg | |
| PeproTech | 重组人IFN-γ (AF) | AF-300-02 | 100μg/250μg/500μg/1mg | 50ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-1α(AF) | AF-200-01A | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 0.1ng/ml |
| PeproTech | 重组人IL-2 (AF) | AF-200-02 | 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 30ng/ml |
| 相关产品 | ||||
| PeproTech | 重组人Flt-3 Ligand (AF) | AF-300-19 | 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | |
| PeproTech | 重组人IL-7 (AF) | AF-200-07 | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | |
| PeproTech | 重组人IL-15 (AF) | AF-200-15 | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | |
| PeproTech | 重组人SCF (AF) | AF-300-07 | 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | |
二、 DC-CIK
| 生产商 | 产品名称 | 产品编号 | 产品规格 | 使用浓度 | |
| 推荐产品 | |||||
| eBioscience | Anti-Human CD3 Functional Grade Purified | 16-0037-85 | 500μg | ||
| PeproTech- biogems | Anti-Human CD3 SAFIRE Purified | 05121-25 | 100μg/500μg | ||
| PeproTech | 重组人 GM-CSF (AF) | AF-300-03 | 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 50-100ng/ml | |
| PeproTech | 重组人 IFN-γ(AF) | AF-300-02 | 100μg/250μg/500μg/1mg | 50ng/ml | |
| PeproTech | 重组人 IL-1α(AF) | AF-200-01A | 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 0.1ng/ml | |
| PeproTech | 重组人 IL-2 (AF) | AF-200-02 | 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 30ng/ml | |
| PeproTech | 重组人 IL-4 (AF) | AF-200-04 | 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg | 100ng/ml | |
| 相关产品 | |||||
| PeproTech | 重组人Flt-3 Ligand (AF) | AF-300-19 | 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg | ||
| PeproTech | 重组人 IL-7 (AF) | AF-200-07 | 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg | ||
| PeproTech | 重组人 IL-15 (AF) | AF-200-15 | 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg | ||
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