简 介
Propidium iodide（溴化丙锭，以下简称PI）几乎无序列偏好性的通过嵌入碱基对而结合DNA。一般而言，一个染料分子结合4-5个碱基对。但同时PI也可以与RNA结合，这就需要使用核酸酶处理，以区分DNA和RNA染色。PI一旦与核酸结合，其荧光即增强20到30倍，其荧光激发波长改变约~30–40nm而为红色，发射波长改变约15nm为蓝色。虽然其摩尔吸光系数（消光系数）相对较低，若使用合适的光学过滤器，PI表现出一个足够大的Stokes位移能够允许同时检测核DNA和荧光标记抗体。
PI可以用荧光显微镜，激光扫描共聚焦显微镜，流式细胞仪和荧光计进行检测。
PI可以穿透细胞膜，通常不能通过活细胞细胞膜。PI常用于鉴定死细胞，同时也作为一个复染剂用于多色荧光技术。
PI荧光光谱特性
当PI与核酸结合，其荧光最大激发波长为535nm，最大发射波长为
617nm（见图1）。PI可被氙气或汞弧灯或与氩离子激光器的488激
光所激发。通常情况下，PI在流式细胞仪的FL2通道检测
图 1 PI结合双链DNA后的荧光激发和发射波长
实验材料及方法
1、复染贴壁细胞用于荧光显微镜
1.1 实验材料
⇒ 荧光显微镜
⇒ 2X SSC
⇒ 无DNA酶的RNA酶
⇒ 抗淬灭剂，如SlowFade® Gold (S36936) 或ProLong® Gold (P36930)抗淬灭剂
1.2 样品制备
⇒ 使用适合您样品的固定步骤。其他染色后，进行PI染色。需要注意的是PI复染需要细胞膜通透。
1.3 RNA酶处理
若样品经多聚甲醛，甲醛或戊二醛固定，需要经RNA酶处理；若样品经甲醇乙酸或丙酮处理，即不需要RNA酶处理。
⇒ 样品使用2X SSC（0.3 M NaCl，0.03 M 柠檬酸钠，pH 7.0）短暂平衡。
⇒ 样品在含100μg/ml 无DNA酶的RNA酶的 2X SSC 中孵育 20min， 37℃。
⇒ 使用2X SSC润洗样品三次，每次1min。
1.4 复染
⇒ 使用2X SSC 平衡样品。
⇒ 使用2X SSC 将1mg/ml（1.5M）PI储液 1:3000 稀释为500nM，通常约300μl足够一个盖玻片染色。使用稀释后的染液覆盖细胞，孵育
1-5min。
⇒ 使用2X SSC润洗样品几次。小心吸干玻片上多余的缓冲液，加入适量的抗淬灭剂如Molecular Probes SlowFade® Gold antifade reagent (S36936) 或 ProLong® Gold antifade
reagent (P36930)。
⇒ 1.4.4 使用荧光显微镜观察样品。
2、复染悬浮细胞用于流式细胞仪
2.1 实验材料
⇒ 流式细胞仪
⇒ PBS
⇒ 乙醇
⇒ Tris 染色缓冲液（见步骤2.3.1）
2.2 样本制备
使用适合于样品的固定方法，或者使用如下步骤。
⇒ 收集2 × 10^5-1 × 10^6个细胞，离心，弃去上清，轻弹管底以用残余液体重悬细胞，加入1ml PBS（室温）。
⇒ 将细胞悬液缓慢转移至4ml高速震荡的无水乙醇（-20℃）中，孵育5-15min（-20℃）。
⇒ 离心，弃去乙醇，轻弹管子，加入5ml PBS（室温），使细胞水合15min。
2.3复染
⇒ 使用染色缓冲液（100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 0.1% Nonidet P-40）1:500稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为3 μM溶液，每个样品需1ml。
⇒ 步骤2.2.3的样品离心，弃去上清，轻弹管底，加入1ml PI溶液，室温，孵育15min，然后在流式细胞仪上分析（在染液存在情况下）。如果要使用荧光显微镜观察，需离心，弃去上清，使用新鲜的缓冲液重悬细胞。取一滴细胞悬液于玻片，盖上盖玻片，使用合适的滤光片观察。
3、复染样品用于染色体荧光原位杂交技术（以下称染色体FISH）
3.1 实验材料
⇒ 荧光显微镜
⇒ dH2O
⇒ PBS
⇒ RNA酶
⇒ 抗淬灭剂（可选）
3.2 样品制备
⇒ 根据标准步骤制备样品（见参考文献3,4）。在复染之前，使用去离子水暂短润洗样品，去除残余的盐缓冲液。空气干燥。最后的润洗对于降低非特异性结合有很大帮助。
3.3 复染
⇒ 使用PBS 1:1000稀释1 mg/mL (1.5 mM)的PI储液为1.5μM的染色溶液。吸取300μL的染色溶液直接加入样品。如果必要，加入终浓度为10μg/ml的Rnase A（新鲜配制）。使用塑料盖玻片使染液均匀分布。
⇒ 室温，避光孵育30min，或者37℃避光孵育（如加入RNase）。
⇒ 去除盖玻片，使用PBS或去离子水润洗，洗去未结合的染料。
⇒ 用吸水纸小心洗去样品周围残余的液体。盖上玻璃盖玻片，石蜡封片。另外，也可以根据操作手册，加入适量的抗淬灭剂。
⇒ 使用荧光显微镜观察细胞。
参考文献
1. J Mol Biol 13, 269 (1965);
2. Methods Cell Biol 30, 417 (1989);
3. Methods Enzymol 168, 741 (1989);
4. Pardue, M.L. in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B.D. Hames and S.J. Higgins, Eds., IRL Press, Oxford, England
(1985).
