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MTT 实验心得体会

作者:丁香通    发布日期:2018-12-11 10:00


实验原理:

MTT 法又称 MTT 比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内, MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、 细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。


实验步骤:

1. 接种细胞:用含 10% 胎牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔合适的细胞数量接种到96孔板,每孔体积 180 ul。

2. 培养细胞:同一般培养条件,可根据试验目的和要求决定培养时间。

3. 呈色:每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml 用 PBS 缓冲液 pH=7.4 配制)20 ul。继续孵育 4 小时,终止培养,小心弃去孔内培养上清液,对于悬浮细胞,需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加 150ul DMSO,振荡 10 分钟,使结晶物充分融解。

4. 比色:选择 490 nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果。


影响实验关键因素:

1. 细胞消化。若消化出现问题,则会影响细胞的活性,进而影响 OD 值。对于 MDA-MB-231、MCF-7、HS-578T 等一系列容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA,消化时也仅需胰酶浸润数秒即可。然而,对于SW480等一系列难以消化的细胞,胰蛋白酶中需添加浓度为 0.25% 的 EDTA。

2. 接种数量。对于细胞接种数量要适宜,过小或过大均会影响 OD 值(过小细胞容易死亡,过大细胞容易生长拥挤)。

几种常见细胞的每孔接种数量如下(个人经验)

3. 培养液的弃去。一般大家喜欢用移液器吸取孔内培养液,吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取,不要触碰底部的紫色结晶。或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。两种方法效果差不多,根据个人喜好选择。

4. 结晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后,将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10~20 min,这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解(尤其在冬天)。


联科生物MTT试剂推荐:


联科生物MTT试剂提供了MTT Solvent和 Formazan Solvent,可直接使用Formazan Solvent溶解结晶物,无需自备DMSO溶液。


使用过程中,若是贴壁细胞,弃去培养基,加入与初始体积等量的Formazan Solvent。非贴壁细胞,直接在培养基中加入与初始体积等量的溶解液。

 
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