小鼠骨髓来源树突状细胞制备法-Lutz 法

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【背景】
1. Lutz 法与 Son 法相似,均可大量制备 BMDC,但与 Son 法相比,Lutz 法更为广泛地被采用,从以下两个方面可以得到印证:

1) 虽然 Lutz 法比 Son 法早发表 3 年(分别是 1999 年和 2002 年),但截至 2015 年12 月,PubMed 中已有 633 篇文献中引用 Lutz 法,而仅有 24 篇文献引用 Son法。

2) 在美国著名的学术社交平台:www.researchgate.net 上有一个交流帖,问:Does anyone have a protocol for generating dendritic cells from mouse bone marrow using GM-CSF? 回答者中大多数推荐和盛赞 Lutz 的 BMDC 培养法。

2. 该法可获得更多的 BMDC,达 1-3 x 108 个/小鼠,而且纯度可达 90-95%;

3. 该法比 Son 法使用的细胞因子浓度低得多,仅为 200U/ml,而且培养的第 8 天到第 10 天降为 30-100U/ml,这样可以大幅节约试剂成本;

4. 该法与 Inaba 经典方法和 Son 法的最大不同是使用细菌培养皿(Petri dish)而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba 的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁,从而抑制巨噬细胞的发育,进而避免巨噬细胞对 DC 成熟的抑制作用,这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量 BMDC 的主要原因。

5. 但该法的培养时间较长,需要 10-12 天,一方面是为了获得更多的 BMDC,另一方面,大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间,因此可提高最终获得的BMDC 的纯度;

6. 该法仅用 GM-CSF 进行诱导培养,得到的 BMDC 中未成熟和成熟 DC 均有,若要进一步提高成熟度,需用 LPS 或 TNF-再诱导 1-2 天,其中成熟 DC 细胞的含量将达到 50-70%。

【培养步骤】

1. 小鼠骨髓细胞的获得

见 Inaba 法(改良)中的相应步骤,注意省去溶血步骤。

2. BMDC 的大量制备

2.1步骤 1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含 10% FBS 的 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 2 x 105/ml;

2.2铺至 100mm 细菌培养皿(Petri Dish)中,每皿 10ml 细胞,同时加入重组小鼠GM-CSF (200U/ml,对于 PeproTech 的 GM-CSF,相当于 20ng/ml),37℃,5%CO2 培养箱培养;

【注】此处使用的是细菌培养皿,而非细胞培养板。

2.3第 3 天时,向培养皿中再加入 10ml 含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液;

2.4第 6 天和第 8 天分别半量换液,即收集旧培养液,离心后用含 20ng/ml 重组小鼠 GM-CSF 的完全培养液重悬细胞沉淀,然后再将细胞悬液放回原皿;

2.5第 10 天时可收集细胞,即为 BMDC。

【注】

1) 此时也可继续培养至第 12 天。若继续培养,可使用 30-100U/ml(即3ng-10ng/ml)的重组小鼠 GM-CSF。

2) 虽然培养时间越长,细胞表型上越成熟(CD11c 的表达量高),但混合淋巴细胞反应实验显示,培养第 8 天和第 10 天收获的 BMDC 具有最强的刺激能力,而培养第 12 天的 BMDC 刺激能力明显减弱。

3) 经过 10 天的培养,每皿平均可收获 9.2 x 106 个细胞。

3. BMDC 的完全成熟

3.1培养第 10 天的 DC 用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞,300 x g 室温离心 5min;

3.2弃上清,用 10ml RPMI 1640 完全培养液重悬细胞沉淀,然后铺于 100 mm 细胞培养板;

【注】

此处不再用细菌培养皿,而是用细胞培养板,因 BMDC 已形成,呈半悬浮状态,骨髓中残留的巨噬细胞前体虽然可贴附于细胞培养板,但不再会对DC 的成熟起到抑制作用,反而会因为其贴于板底而使悬液中的 DC 的纯度更高。

3.3加 入 重 组 小 鼠 GM-CSF(100U/ml , 相 当 于 PeproTech 的 10ng/ml) 和TNF- (500U/ml),或重组小鼠 GM-CSF(100U/ml,相当于 PeproTech 的 10ng/ml) 和 LPS (1g/ml);

3.437℃,5% CO2 培养箱继续培养 1-2 天。