流式细胞术 — 细胞凋亡数据分析技巧讲义

细胞凋亡概念及其特征

细胞凋亡（Apoptosis）：也称细胞程序性死亡（Programmed Cell Death，PCD），是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用，属于细胞的“自杀”行为。

细胞凋亡的典型特征

  1. 线粒体膜电位的丧失；
  2. 细胞膜PS（磷脂酰丝氨酸）的外翻；
  3. 细胞核凝缩和断裂。

凋亡 (Apoptosis)

程序性死亡，机体为更好地适应生存环境而采取的一种主动死亡过程。

凋亡研究热度分析

细胞凋亡与疾病

凋亡不足 凋亡过度
肿瘤 心血管疾病
自身免疫病 血液系统疾病
病毒感染 重症肝炎
退行性神经疾病
如老年痴呆症
帕金森症

细胞凋亡热点问题

  • 细胞接受胞外信号的刺激启动凋亡
  • 胞内凋亡特异性蛋白酶（如Caspase）的活化
  • 线粒体对凋亡的调控
  • Bcl-2蛋白家族对凋亡的调控

凋亡分期

早期事件：
Ø磷脂酰丝氨酸(PS)外翻Ø线粒体受损Ø细胞色素C释放		 中期事件：
ØCaspase 3/7/8/9活化		 晚期事件：
ØDNA片段化

凋亡检测 —— Annexin V

关键技术 9 项

  1. 接种 对数生长
    细胞密度通常不超过1×106/ml，以免引起凋亡
  2. 收集 上清消化全收
    因部分凋亡细胞可能悬浮于培养基中，须先收集上清，离心收集沉淀，再消化收集贴壁细胞，合并上清和消化下来的细胞。
  3. 消化 Accutase
    避免因消化过度使PS外翻，造成假阳性。
    用eBioscience的Accutase酶替代胰酶，在多种细胞系中得到验证，对细胞更温和、长时间消化也没有影响。（对凋亡不明显的实验强烈推荐）使用细胞消化液－－实际效果比较
  4. 阳性质控 联科 Multisciences
    没有明显的凋亡，该如何调节补偿以及设门？
    联科凋亡试剂盒配备阳性质控液，使补偿调节更方便。
  5. 方案 4管 单双混合
    染色
    • Blank
    • Annexin V
    • PI
    • Annexin V+PI

    上机

    • Blank
    • 50%Blank +50%Annexin V
    • 50%Blank +50% PI
    • 50%Blank+50%Annexin V+PI
    • 50%Blank+25%Annexin V+PI+25%Annexin V
  6. 电压 足够大，大到快要超出边界。
  7. 细胞数量 足够多，多到细胞全部收集。
  8. 补偿 横平竖直：3、4象限横平；2、4象限竖直
  9. 漂亮图片 黄金分割（三分原则）。