流式细胞术 — 细胞凋亡数据分析技巧讲义

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作者:联科生物 发布日期:2021-08-16 09:00

细 胞 凋 亡 概 念 及 其 特 征细胞凋亡(Apoptosis):也称细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD),是为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡,在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用,属于细胞的“自杀”行为。
细胞凋亡的典型特征:

1)线粒体膜电位的丧失;

2)细胞膜PS(磷脂酰丝氨酸)的外翻;

3)细胞核凝缩和断裂。
凋亡 (apoptosis)
程序性死亡,机体为更好地适应生存环境而采取的一种主动死亡过程。

凋 亡 研 究 热 度 分 析细胞凋亡与疾病:

凋亡不足 凋亡过度
肿瘤 心血管疾病
自身免疫病 血液系统疾病
病毒感染 重症肝炎
退行性神经疾病
如老年痴呆症
帕金森症

细胞凋亡热点问题:
? 细胞接受胞外信号的刺激启动凋亡

? 胞内凋亡特异性蛋白酶(如Caspase)的活化

? 线粒体对凋亡的调控

? Bcl-2蛋白家族对凋亡的调控
凋 亡 分 期

早期事件:
Ø磷脂酰丝氨酸(PS)外翻Ø线粒体受损Ø细胞色素C释放
中期事件:
ØCaspase 3/7/8/9活化
晚期事件:
ØDNA片段化

凋亡检测 —— Annexin V 关键技术 9 项
1,接种 对数生长

细胞密度通常不超过1×106/ml,以免引起凋亡

2,收集 上清消化全收

因部分凋亡细胞可能悬浮于培养基中,须先收集上清,离心收集沉淀,再消化收集贴壁细胞,合并上清和消化下来的细胞。

3,消化 Accutase

避免因消化过度使PS外翻,造成假阳性。

用eBioscience的Accutase酶替代胰酶,在多种细胞系中得到验证,对细胞更温和、长时间消化也没有影响。(对凋亡不明显的实验强烈推荐)使用细胞消化液--实际效果比较

4,阳性质控 联科 Multisciences

没有明显的凋亡,该如何调节补偿以及设门?

联科凋亡试剂盒配备阳性质控液,使补偿调节so easy

5, 方案 4管 单双混合

染色:1, Blank、2, Annexin V、3, PI、4, Annexin V+PI

上机:1, Blank、2, 50%Blank +50%Annexin V、3, 50%Blank +50% PI、4, 50%Blank+50%Annexin V+PI、 5, 50%Blank+25%Annexin V+PI+25%Annexin V

6,电压 足够大

大到快要超出边界。

7,细胞数量 足够多

多到细胞全部收集。

8,补偿 横平竖直

3、4象限横平;2、4象限竖直

9,漂亮图片

黄金分割(三分原则)。

关键技术 9 项1,接种:对数生长

2,收集 :上清消化全收

3,消化:Accutase

4,阳性质控:联科 Multisciences

5,方案:单双混合

6,电压:足够大

7,细胞数量:足够多

8,补偿 :横平竖直

9,漂亮图片 :黄金分割