ELISA通关必备(6)丨样本篇丨不常见样本

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利用ELISA(酶联免疫吸附测定)进行检测的样本类型包括常见的血液(血清、血浆),组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清以及不常见的皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水等,这些样本收集的时间、处理方法和保存都会影响到ELISA实验的结果。下面对几种不常见样本处理方法整理,希望对您有所帮助。

 

  • 唾液

在唾液样本采集之前,受试者被建议不要吃东西、抽烟或喝饮料。用盐水彻底漱口后,采集唾液3 mL。立即以4000 rpm的速度离心15分钟,以除去任何颗粒或沉积物。将上清液分装并在−70℃下储存备用。

参考文献:

Aydin, S., I. Halifeoglu, I. H. Ozercan, F. Erman, N. Kilic, S. Aydin, N. Ilhan, N. Ilhan, Y. Ozkan, N. Akpolat, L. Sert and E. Caylak (Aydin, Halifeoglu et al.). "A comparison of leptin and ghrelin levels in plasma and saliva of young healthy subjects." Peptides 26(4): 647-652.

 

  • 痰液

根据标准方案收集并制备诱导痰:

  1. 分离粘液
  2. 测量粘液
  3. 添加与粘液相同体积的二硫苏糖醇(1%)
  4. 涡流
  5. 使用滤纸并收集过滤液
  6. 300 g离心30min
  7. 分离上清液并保持在−20℃

参考文献:

Majd, A. M. M., S. Faghihzadeh, S. Pourfarzam, M. Eghtedardoost, D. Jamali, E. S. Mirsharif, R. Dilmaghanian and T. Ghazanfari (2019). "Serum and sputum levels of IL-17, IL-21, TNFalpha and mRNA expression of IL-17 in sulfur mustard lung tissue with long term pulmonary complications (28years after sulfur mustard exposure)." Int Immunopharmacol 76: 105828.

 

  • 尿液

早上7点到8点,用无菌管收集第一次晨尿,存于-80℃备用。离心20分钟左右(2000-3000 rpm)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

参考文献:

Wasilewska, A., K. Taranta-Janusz, W. Debek, W. Zoch-Zwierz and E. Kuroczycka-Saniutycz. "KIM-1 and NGAL: new markers of obstructive nephropathy." Pediatr Nephrol 26(4): 579-586.

 

  • 精液

应在禁欲至少2天和最多7天之后收集样本。如果需要额外的样本,每次访视时禁欲天数应尽可能恒定。样本应在实验室附近的房间内收集,以限制精液的温度波动,并控制采集和分析之间的时间间隔。

样本容器应保持在20℃到37℃之间的环境温度,以避免温度发生较大变化,这可能会影响精子射入后的情况。

正常精液射出体外呈稠厚的胶冻状,射出体外后需在室温或37℃水浴箱中使其在前列腺分泌的纤维蛋白溶解酶的作用下液化,变的稀薄。待精液完全液化后,将精液 4000 rpm 离心 10 分钟分离精浆进行检测。

参考文献:

World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO Press; 2010.

Zupin, L., V. Polesello, M. Martinelli, S. Luppi, E. Giolo, G. Zito, F. Romano, L. Segat, S. Crovella and G. Ricci (2019). "Human beta-defensin 1 in follicular fluid and semen: impact on fertility." J Assist Reprod Genet 36(4): 787-797.

 

  • 肺泡灌洗液

  1. 在纤支镜下,按常规方法行支气管肺泡灌洗。每次注入无菌生理盐水20 ml,然后缓慢洗出,每例注入总量约200 ml,其回收率50-60%。回收肺泡灌洗液,1000 rpm 离心10分钟,取上清分装-80℃冻存备用。

参考文献:

李固本,Peter; B. Bitterman (1990).“支气管肺泡灌洗液白蛋白含量的ELISA测定”《湖南医科大学学报》第3期

  1. BALF样本从进行呼吸道症状常规调查的患者身上采集。对样本进行离心和无菌过滤,以去除细胞碎片和结核分枝杆菌。

参考文献:

Singh, S., G. Maniakis-Grivas, U. K. Singh, R. M. Asher, F. Mauri, P. T. Elkington and J. S. Friedland (2018). "Interleukin-17 regulates matrix metalloproteinase activity in human pulmonary tuberculosis." J Pathol 244(3): 311-322.

 

  • 脑脊液

人脑脊液的抽取:临床上都用的是腰椎穿刺术。具体的方法是将患者左侧卧位,屈颈、屈髋、屈膝,取腰3、4为穿刺点,经过常规的消毒铺巾以后,在腰3、4的位置局部浸润麻醉,将腰穿针插入,当腰穿针进入蛛网膜下腔以后,把腰穿针中间的针芯抽出,即可流出澄清或者是有颜色、有病变的脑脊液。但是在抽取脑脊液之前需要测量脑脊液的压力,然后再留取脑脊液,脑脊液留取的过程中要注意速度要缓慢,并且量要根据颅内压的状况进行具体的调节,不宜过多也不宜过少。样本收集后于 1000g 离心 20 分钟,离心后收集上清,并将标本保存于-20度,且应避免反复冻融。

大小鼠的脑脊液量都不多,尤其是小鼠的,通常只能有几微升。我们实验室的做法是用一根胰岛素注射器前面再连接一根比较细的透明管子,管子的另一端与折下的胰岛素注射器针头连接。深麻老鼠后,我们只需要找到老鼠的枕骨大孔,让针头垂直于枕骨的角度插入枕骨大孔。不要插入太深,当手指有破空感的时候就停止,然后用胰岛素注射器缓慢回抽(由于大小鼠的脑脊液很少,回抽的力度应很小,速度不应快,防止脑内压增大)。当大小鼠的脑脊液抽完后,你就可以在透明管子中看到清澈的脑脊液从某一段突然变红了。这个时候用止血钳夹住红色段的上缘,接着用剪刀沿剪去红色的部分。样本收集后于 1000g 离心 20 分钟,离心后收集上清,并将标本保存于-20度,且应避免反复冻融。

 

  • 胸水

患者经胸腔穿刺取胸腔积液10 mL于无菌管内。3000 g下离心10分钟,上清液在-80℃下冻存备用。

参考文献:
Hong, J. Y., S. Y. Park, Y. Kim, C. Y. Lee and M. G. Lee (2018). "Calpain and spectrin breakdown products as potential biomarkers in tuberculous pleural effusion." J Thorac Dis 10(5): 2558-2566.