流式常见Th检测实验技能,你会了吗?

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流式检测Th1、Th2以及Th17细胞是免疫学研究中的一项重要技术,主要用于检测和分析这些不同亚型的辅助性T淋巴细胞(Th细胞)在免疫应答中的作用和平衡状态。

小科今天给大家带来Th1/Th2/Th17细胞的简要介绍,并讲解其检测指标以及实验所需的一些注意事项。

一、Th1/Th2/Th17细胞介绍

1.Th1细胞:Th1细胞主要介导细胞免疫应答,促进炎症反应和清除胞内病原。它们分泌的细胞因子如IFN-γ、IL-2和TNF-α等,在免疫应答中发挥关键作用。

2.Th2细胞:Th2细胞主要参与体液免疫应答,促进过敏反应和寄生虫感染的清除。它们分泌的细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13等,在体液免疫和过敏反应中发挥重要作用。

3.Th17细胞:Th17细胞是近年来发现的一种新的Th细胞亚群,主要分泌IL-17等细胞因子,参与炎症反应和组织损伤。它们在自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤等疾病的发生和发展中扮演重要角色。

图片来源:网络

二、Th1/Th2/Th17细胞检测指标选择

小科查阅相关Th高分文献,帮大家总结了Th1/Th2/Th17细胞常见流式检测指标

人以及大鼠样本Th1/Th2/Th17细胞检测指标

(备注:Th 细胞的表面标志为 CD3+CD4+,而当用 PMA /Ionomycin刺激人和大鼠抗凝血 4 小时,会发现 CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为 PMA/Ionomycin 会诱发细胞表面 CD4 分子被内吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8 反设 CD4 细胞,即 CD3+CD8-的细胞被认为是 CD3+CD4+的细胞。)

小鼠样本Th1/Th2/Th17细胞检测指标

联科生物Th试剂盒

工作簿1_联科生物Th试剂盒.jpg

联科Th试剂盒部分引用文献

1、Wang, Hongxing et al. T-Cell Immune Imbalance in Rheumatoid Arthritis Is Associated with Alterations in NK Cells and NK-Like T Cells Expressing CD38. Journal of innate immunity vol. 14,2 (2022): 148-166.

2、Ding Y, Wang Y, Zhang Y, et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine. 2023;116:154825.

3、Yu Q, Yu F, Li Q, et al. Anthocyanin-Rich Butterfly Pea Flower Extract Ameliorating Low-Grade Inflammation in a High-Fat-Diet and Lipopolysaccharide-Induced Mouse Model. J Agric Food Chem. 2023;71(31):11941-11956.

4、Li Q, Liu W, Zhang H, et al. α-D-1,3-glucan from Radix Puerariae thomsonii improves NAFLD by regulating the intestinal flora and metabolites. Carbohydr Polym. 2023;299:120197.

三、流式检测Th1/Th2/Th17细胞实验步骤

进行流式检测Th1/Th2/Th17细胞常规的实验步骤由以下六个部分组成

资源 2结构.jpg

下面是采用联科生物的试剂盒检测人外周血Th1/Th2/Th17细胞具体步骤:

示例:人的外周血Th1/Th2/Th17细胞检测

试剂盒采用了联科生物人Th1/Th2/Th17染色试剂盒

产品名称:Human Th1/Th2/Th17 Staining Kit

货号:KTH001

样本:人的外周血

实验步骤

1、采用肝素抗凝管取血,取125 u L抗凝血至流式管中,加入125 u L不含血清的培养基和1 u L PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 u L BFA/Monensin Mixture (250×)。取125 u L抗凝血和125 u L不含血清的培养基,作为对照。混匀,37℃孵育4 - 6 小时,每隔1 - 2 小时取出震荡混匀。

2、从样本管和对照管中取100 u L 细胞悬液至新的流式管中,加入5 u L Anti-Human CD3, APC-Cy7和5 u L Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5。震荡混匀,室温避光孵育15分钟。

3、每管加入100 u L FIX & PERM Medium A,震荡混匀,室温避光孵育15分钟。

4、每管加入1 ml预冷1× Flow Cytometry Staining Buffer,300 × g离心5分钟,弃上清。

注:液体尽量倒干净,不要有残留。

5、每管加入 100 u L FIX & PERM Medium B、5 u L Anti-Human IFN-γ, FITC、5 u L Anti-Human IL-4, APC 和 5 u L Anti-Human IL-17A, PE。震荡混匀,室温避光孵育 15 分钟。

6、每管加入 1 m L 1× Flow Cytometry Staining Buffer,300 × g 离心 5 分钟,弃上清。

7、每管加入 500 u L 1× Flow Cytometry Staining Buffer 重悬,上机检测;或者加入 500 u L 1 - 4 %多聚甲醛重悬,2 - 8℃避光,于 24 小时内检测。

实验结果示意图;

如上图所示,首先根据FSC/SSC确定淋巴细胞进行圈门,利用CD3+圈出T淋巴细胞群;再分别根据IFN-γ+和CD8-表示Th1细胞群、IL-4+和CD8-表示Th2细胞群以及IL-17A+和CD8-表示Th17细胞群,进行圈门。

四、流式检测Th1/Th2/Th17细胞实验注意事项

1.当使用血液样本不需要提取PBMC时,需要采用肝素抗凝管收集样本;

2.当使用血液样本需要提取PBMC时,收集样本可以选择EDTA管也可以选择肝素抗凝管;

3.做Th实验时,需要做一个生物阴性对照(或者同型对照),因为我们能检测到的细胞因子数量少,不利于我们后续进行数据分析圈门;

4.刺激剂如PMA(佛波酯)和Ionomycin(离子霉素)常联合使用,会导致人T细胞表面CD4发生内吞,所以我们通常的做法是用 CD3 和 CD8 来反设 CD4 细胞,即 CD3+CD8-的细胞被认为是 CD3+CD4+的细胞;

5. 进行流式仪上机操作时,收取 20000 - 30000个 CD3+CD8-(CD4+) T 细胞,对于某一细胞因子,因人而异,分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较,需要获取足够多的细胞样本。