大鼠外周血样本Th17流式实验操作步骤

1. 取样本

样本收集和处理: 使用肝素作为抗凝剂，收集适量抗凝血，室温或2-8℃ 保存，并于当天进行检测。

2. 相关检测试剂

目录号 产品名称 规格 备注
F3100401 Anti-Rat CD4, FITC(Clone:OX-38) 检测试剂 100T/25T 表面染色
F21IL1702 Anti-Mouse/Rat IL-17A, PE (Clone:17B7)检测试剂 100T/25T 胞内染色
S1001 Flow cytometry Staining buffer流式染色缓冲液 125ml 流式染色缓冲液，用于染色和洗涤,100T建议配3瓶
CS1001 PMA/Ionomycin mixture(250X)佛波酯/离子霉素混合物 100ul/500ul 刺激剂
CS1002 BFA/Monensin Mixture(250X)布雷非德菌素A/莫能霉素混合物 100ul/500ul 阻断剂
GAS005 Fix & Perm Kit固定破膜剂 100T 固定破膜剂，里面的组分同时有裂解红细胞的作用

3. 实验设计分组

分组类型 处理方式 核心作用
阴性 / 空白对照 不进行任何抗体染色 排除细胞自身荧光干扰，设定基础信号阈值
单染 / 单阳对照 仅染 CD4-FITC 抗体 / 仅染 IL-17A-PE 抗体 调整流式仪器补偿，确保两种荧光信号不串扰
同型对照(可选) 染IL-17A-PE对应的同型对照抗体 排除抗体非特异性结合的干扰，验证染色特异性
未刺激对照 不加刺激阻断剂(货号CS1001和CS1002,染CD4-FITC、IL-17A-PE） 生物学对照
实验组 按实验设计（如不同诱导条件）染 CD4-FITC、IL-17A-PE 抗体 检测目标样本中 Th17细胞的实际比例

4. 样本刺激

3a. 对于肝素抗凝血，取125μl 抗凝血至流式管中，加入125μl 不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。取 125μl 抗凝血和 125μl 不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育5小时，每隔1小时取出震荡混匀。

5. 样本染色

①　从样本管和对照管中取100μl细胞悬液至新的流式管中，加入5 μl Anti-rat CD4, FITC。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。
②　每管加入100μl FIX&PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15分钟。
③　每管加入1ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 × g离心5分钟，弃上清。
④　每管加入100μl FIX& PERM MediumB和5μl Anti-rat IL-17A, PE或者同型对照抗体。震荡混匀，室温避光孵育15分钟。
⑤　每管加入1ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 × g 离心5分钟，弃上清。
⑥ 每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测；

6. 上机检测注意事项

① 调节电压和补偿：使用补偿微球或样本对流式细胞仪进行电压和补偿调节。补偿微球通常比目的细胞小，在调节 FSC/SSC 电压和细胞设门时需要注意。
② 正确设门以得到Th17细胞在CD4+辅助T细胞中的比例。注：至少获取20,000-30,000 CD4+T细胞。对于某一细胞因子，因品系和个体差异，分泌该细胞因子的细胞比例差异很大。为了进行统计学差异比较，请获取足够多的细胞样本。