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MTT法检测细胞增殖

作者:小科    发布日期:2020-11-17 08:30



MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。


检测步骤

◆ 1.将细胞板放置于无菌操作台中(细菌可以导致MTT比色OD值的升高)

◆ 2.在每管MTT(5 mg/每管)中加入1 mL MTT Solvent溶解。在细胞板中每孔加入10%体积的MTT溶液。

注:MTT 对光敏感。重溶的MTT溶液冻存于0℃以下时的稳定性可至少保持6个月。重溶的MTT溶液如保存于2 - 8℃超过2周,则可能会降解,导致错误的结果。

◆ 3.将细胞板放回培养箱中继续孵育3 - 4小时。做对比试验时,孵育时间需一致。

◆ 4.孵育后将细胞板从培养箱中拿出,按照下面的方法溶解产生的MTT甲臜结晶物。

a. 如果是贴壁细胞,则弃去培养基。加入与初始体积等量的Formazan Solvent。每孔的溶解液体积可能不同,但为了方便比较,总体积须保持一致。

b. 如果是非贴壁细胞先离心去除上清液,再加入与初始体积等量的Formazan Solvent。

c. 加入 Formazan Solvent后,须在1小时内完成读数。

◆ 5.在摇床中温和地振荡可增强溶解。某些情况下,尤其是细胞密度较高时,需要反复吹打使 MTT甲臜结晶物完全溶解。

◆ 6.将细胞板放置于无菌操作台中(细菌可以导致MTT比色OD值的升高)。

 

注意事项

◆ 1. 一般情况下,96孔培养板内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行MTT试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,保证MTT结晶形成的量与细胞数呈线性关系;

◆ 2. 为了得到最好的结果,细胞数量应在对数生长期进行测定。每次检测需包括不含细胞的培养基作为空白对照;

◆ 3. 细胞消化会影响细胞的活性,进而影响OD值。容易消化的细胞,消化时胰蛋白酶中不添加EDTA,消化时也仅需胰酶浸润数秒即可;难以消化的细胞,胰蛋白酶中需添加浓度为0.25%的EDTA;

◆ 4. MTT转化为甲臜是依赖于细胞类型的。由于相同细胞系不同细胞株之间的差异,以及细胞的生理状态影响,因此推荐研究者建立自己的吸光度/细胞数量曲线;

◆ 5.细菌、支原体和其他微生物污染可能会使MTT四唑环断裂,不能用该方法测定;

◆ 6. 用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高的血清物质会影响试验孔的光吸收值,增加试验本底。因此,一般选含小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

◆ 7. CCK-8法也是常见的细胞增殖检测方法,底物被细胞中的脱氢酶还原,生成黄色的产物(甲瓒),可溶于培养基。相较于MTT,CCK-8具有如下优点:①单一组分,无需预混,即开即用;②操作简便,只需一步即可得到结果;③无需放射性同位素和有机溶剂,对细胞毒性低;④水溶液,无需换液,尤其适合悬浮细胞。

 

细胞增殖检测相关试剂盒
 

目录号 产品名称 规格
70-MTT MTT细胞增殖检测试剂盒 100/200/500/1000 assays
70-CCK8 CCK-8细胞增殖检测试剂盒 100/200/500/1000/3000/10000 T
70-CP001 BrdU Cell Proliferation Assay Kit 细胞增殖试剂盒 50 T
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