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要想流式做得好,荧光知识少不了

作者:小科    发布日期:2020-06-02 08:00


上一期我们讲到流式实验的三大要素是样本(细胞或颗粒)、流式细胞仪和荧光素偶联抗体,进而讲到了荧光素的选择问题,本期让我们回过头来了解了解常见荧光素的特点。荧光素按激发光波长来分,主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类,其中,常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素,如FITC、PE、APC、PI等。

 

{  激发波长为488 nm的荧光素 }


1. 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC):FITC是应用最为广泛的一种荧光素,经激光激发后发出明亮的黄绿色荧光,最大发射波长为525 nm。FITC的荧光强度受PH影响较大,常随着PH的降低而减弱,因此,在使用FITC时需格外注意溶液的酸碱度。


2. Alexa Fluor 488:Alexa Fluor是美国分子探针公司开发的系列荧光染料,Alexa Fluor 488的发射光谱与FITC几乎一致,经激光激发后发出绿色荧光,最大发射波长为519 nm,但其荧光强度和稳定性要优于FITC。一般来说,Alexa Fluor 488在pH 4-10范围内能保持较好的光稳定性。


3. 藻红蛋白(phycoerythrin,PE):PE是从红藻中分离纯化获得的一种常见染料,经激光激发后发出橙黄色荧光,最大发射波长为575 nm。PE具有吸光性能好和光量子产率高的特点,可用于标记表达水平较低的蛋白。在流式细胞术检测中,PE标记的抗体适用于所有配备488 nm氩离子激光器的流式细胞仪。


4. PE-Cy5:PE-Cy5是一种复合染料,属于藻红蛋白偶联物,在此类复合染料中,激发能量可从PE传递到Cy5上,最大发射波长为667 nm。由于PE-Cy5与FITC、PE在光谱上重叠范围较少,荧光干扰少,因此实验中常将PE-Cy5与FITC、PE搭配使用。需注意,PE-Cy5不适合与APC搭配使用,两者荧光重叠大。


5. PE-Cy5.5:PE-Cy5.5也是一种复合染料,能量从PE传递到Cy5.5上,最大发射波长为694 nm。同PE-Cy5不一样,PE-Cy5.5与FITC、PE、APC间荧光干扰小,可搭配使用,且其荧光强度要优于PE-Cy5。


6. PE-Cy7:复合染料,最大发射波长为785 nm。PE-Cy7与FITC无光谱重叠,与APC重叠也较少,因此其可与FITC、PE、APC搭配使用。在实验中需要注意,PE-Cy7的光淬灭性很强,需要绝对避光环境。


7. PerCP-Cy5.5:复合染料,最大发射波长为695 nm。与PerCP相反,PerCP的光量子产率较低,适用于表达水平较高物质的检测,PerCP-Cy5.5光量子产率高,可用于表达水平较低物质的检测。在双激光管仪器上与APC共同检测时,需要做补偿调节,但比PerCP补偿少。


8. PI/7-AAD:碘化丙啶(propidium iodide,PI)和7-AAD(7-amino-actinomycin D)的最大发射波长分别为617 nm和647 nm,是常见的荧光染料,常用于细胞凋亡检测,可用于鉴别死、活细胞。在大部分流式细胞仪上,PI在FL2或FL3通道检测,7-AAD在FL3通道检测。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性,但其发射波谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

 

{  激发波长为633 nm的荧光素 }


1. 别藻青蛋白(allophycocyanin,APC):APC最大发射波长为660 nm,其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。FITC、PE和APC搭配是经典3色搭配。


2. Cy5:Cy5属于小分子染料,其最大发射波长为670 nm,其标记的抗体适用于所有配备633 nm氩离子激光器的流式细胞仪,检测通道一般是FL4通道。除流式细胞术外,Cy5同样适用于传统的荧光显微镜技术。需注意的是,Cy5与单核细胞和粒细胞的非特异性结合多,实验结果容易出现假阳性。


3. Alexa Fluor 647:Alexa Fluor 647是一种明亮的红色荧光染料,其最大发射波长为668 nm,一般在流式细胞仪的FL4通道检测。Alexa Fluor 647具有荧光量子产率高、光稳定性好、适宜的pH范围广和不易淬灭等特点,是APC和Cy5的优质替代品。

 

{  常用荧光素及相应检测通道 }

 
激发光波长 检测通道 荧光素
488 nm FL1
FITC、Alexa Fluor 488、GFP、Fluo-3
FL2
PE、PI
FL3
PE-Cy5、PE-Cy5.5、PerCP、PerCP-Cy5.5、   PE-Texas Red、7-AAD
FL4
PE-Cy7、PE-Alexa Fluor 750
633 nm FL5
APC、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、     Alexa Fluor 700
FL6
APC-Cy7、APC-Alexa Fluor 750
375 nm FL7
Hoechst33342-Blue、DAPI
FL8
Hoechst33342-Red
405 nm FL7
Alexa Fluor 405、Pacific Blue
FL8
Pacific Orange


注:不同型号流式细胞仪的各检测通道对荧光素的检测能力是不同的,上表仅为较常见情况,具体检测通道可检测荧光素的信息以流式细胞仪配置为准。

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