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当我开始做流式的时候,师兄居然给了我这个…

作者:小科    发布日期:2020-05-26 09:00



自1973年世界第一台商用流式细胞仪诞生,流式细胞仪的应用范围随着性能的不断完善而越来越广泛。相对应地,流式细胞术作为一种可在流动状态下快速地实现对多个检测目标多参数特性分析的技术,在免疫学、血液学、肿瘤和干细胞治疗等领域发挥着重要的作用。


做流式实验绕不开的三大要素:样本(细胞或颗粒)、流式细胞仪、荧光素偶联抗体。

 

  {  单 细 胞 悬 液 制 备  }
 

流式细胞术实验样本通常为0.5-50 μm范围内各种细胞(如外周血、骨髓、细胞穿刺、灌洗液、实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞),微生物,人工合成微球。想要流式的染色结果好,必须用单细胞悬液,细胞团和细胞碎片容易堵塞进样管。以下是将四种常见的流式样本制备成单细胞悬液的方法:

 

一、组织培养细胞

► 所需试剂器皿:

Accutase酶(联科生物 Cat#AT001)、流式染色缓冲液(联科生物 Cat#S1001)、15 ml或50 ml离心管。

► 实验步骤:

1、 对于悬浮生长的细胞,将细胞转移至离心管中,进行计数和活力分析后进入第3步;

2、 对于贴壁生长的细胞系,推荐用Accutase酶将细胞从培养皿中消化下来并分离聚集细胞。将细胞转移至离心管中进行计数和活力分析后进入第3步(注意:Accutase酶会改变某些细胞的表面抗原表位);

3、 离心后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*107 cells/ml。


二 、淋巴组织细胞

一般来说机械分离淋巴组织足够将细胞释放为单细胞悬液。

► 所需试剂器皿:

60 mm×15 mm的组织培养皿、3 ml注射器、细胞过滤器(尼龙滤网)、流式染色缓冲液、15 ml或50 ml离心管。

► 实验步骤:

1、 将获得的组织(脾脏、淋巴结、胸腺)放入到组织培养皿中,用3 ml注射器活塞加压的方法把组织分散为单细胞悬液(或者可以在10 ml流式染色缓冲液中用两片载玻片把组织压成糊状);

2、 用10 ml流式染色缓冲液收集细胞,并将细胞悬液通过过滤器以除去细胞团和细胞碎片。将悬液收集到离心管中;

3、 4℃,300-400 g离心细胞悬液4-5 min,去除上清液;

4、 重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;
5、 重复步骤3后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*107 cells/ml。
 

三、非淋巴组织细胞

► 所需试剂器皿:

剪刀或手术刀片、PBS或其他合适的生理缓冲液、60 mm×15 mm的组织培养皿、3 ml注射器、细胞过滤器(尼龙滤网)、流式染色缓冲液、15 ml或50 ml离心管。

► 实验步骤:

1、 将组织用剪刀或手术刀片弄成2-4 mm大小的碎块;

2、 加入用PBS稀释的适量的酶,最佳孵育的时间和温度参考所用酶的操作说明书(注意:酶的种类取决于组织的类型);

3、 用移液枪轻轻吹打分散细胞后,用过滤器过滤除去细胞团和碎片,收集细胞悬液至离心管中;

4、 4℃,300-400 g离心细胞悬液4-5 min,去除上清液;

5、 用PBS重悬细胞,去除多余的酶溶液;

6、 按步骤4的方法离心;

7、 重复步骤5和6;

8、 用流式染色缓冲液重悬细胞,并进行计数和活力分析;

9、 按步骤4的方法离心,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*107 cells/ml。


四、从全血中分离PBMC

► 所需试剂器皿:

PBS、Ficoll或者其他密度梯度分离液、流式染色缓冲液、15 ml或50 ml离心管。

► 实验步骤:

1、 将全血用PBS 1:1在锥形管中稀释;

2、 在稀释的样本上面加入等体积的Ficoll;

3、 1000 g离心20 min;

4、 将位于PBS和Ficoll层间的PBMC转移到一个新的管中;

5、 加入PBS清洗细胞;

6、 4℃,300-400 g离心细胞悬液4-5 min,去除上清液;

7、 用流式染色缓冲液重悬沉淀细胞并做计数和活力分析;

8、 重复步骤6后,将细胞用流式染色缓冲液重悬至细胞浓度为2*107 cells/ml。

 

{  荧 光 素 选 择  }


在流式细胞术实验,各种荧光素标记的抗体也是必不可少的。那么荧光素该如何选择呢,通常会参考以下5个方面:

 

一、流式细胞仪配置

仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光。附常见荧光素的激发波长和发射波长:
 

 

二、染料的亮度与抗原表达量相匹配

低表达抗原,推荐使用亮荧光染料;高表达抗原,推荐使用弱荧光染料。

 

 

三、荧光染料重叠最小化

尽量选择光谱重叠小的荧光素,如FITC/PE-Cy7;选择不同激光激发的荧光素,如FITC/APC,PE/APC。光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏,需调节补偿。

 

四、避免复合染料联合使用带来的假阳性

常见的复合染料有PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5、APC-Cy7等,复合染料的信号衰退会降低APC或PE的灵敏度。

 

五、尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本

每种细胞群都有不同水平的自发荧光。所有的荧光通道均可观察到自发荧光,但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞,选择红光激发,发射波长长的荧光素(如APC)可得到较好的S/N比值;对自发荧光比较弱的细胞,发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善,可选用FITC。

 

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