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Th17 检测原理和样品处理方法

作者:联科生物    发布日期:2018-11-29 13:00


我们通常所说的 Th1、Th2 和 Th17 是指 T 辅助细胞(严格意义上是 Th0 细胞)在各种生理与病理条件下分化为 Th1、Th2 和 Th17 的能力。静息状态(即未受任何刺激,如人的正常生理状态)下,Th0 分化为 Th1、Th2 和 Th17 的能力非常弱,所以外周血中仅含有极少量的 Th1、Th2 和 Th17 细胞,这时我们所能检测到的 IFN-γ、IL-4、IL-17A 也微乎其微。而当 Th 细胞受到外界因素,如刺激素,病原体等刺激,其中 Th0 即会向 Th1、Th2或 Th17 大量分化,具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时,我们检测到的 IFN-γ、IL-4 或 IL-17A 也较多。实验中我们检测的 Th1、Th2 和 Th17 实际上是检测 Th 细胞对刺激素刺激的反应能力。


我们通常选用的刺激素为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。


其中 PMA 为 PKC(蛋白激酶 C)的激活物,PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致许多蛋白的表达,进而引起 T 细胞的活化。在细胞内,PKC 可被 DAG(二脂酰甘油)和 Ca2+的共同作用而激活,因此在 Ionomycin(Ca2+的转运剂,可将细胞器内的 Ca2+转运至胞浆内)的参与下,T 细胞内 PKC 可被进一步激活。可见,PMA与 Ionomycin 协同活化 T 细胞。


也有人选用其它刺激剂来活化 T 细胞,如 CD3/CD28 协同刺激,PHA 刺激等。实验表明,PMA 为广谱性刺激,即 T 细胞中的各亚群均会被 PMA 同等激活,而 CD3/CD28协同刺激和 PHA 刺激,则是通过 TCR 受体的作用,仅对部分 T 细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。


活化的 T 细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi),因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运,才能到达细胞膜,然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。我们通常选用的阻断剂为 BFA 或 Monensin, 其中 BFA 的阻断效果优于 Monensin, 但由于前者价格较昂贵,现实验中多用 Monensin 来替代 BFA.


另外,实验过程中涉及到如何正确的选定 Th(即 T 辅助细胞)的问题。 Th 细胞的表面标志为 CD3+CD4+,而当用 PMA 刺激 4 小时时,会发现 CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为 PMA 会诱发细胞表面 CD4 分子被内吞。所以通常的做法是用 CD3 和 CD8反设 CD4 细胞,即 CD3+CD8-的细胞被认为是 CD3+CD4+的细胞。(注:PMA 对小鼠 CD4的影响很小,所以检测小鼠 Th1/Th2/Th17 时可用 CD4 直接设门)。

详细实验步骤:


1. 标本采集及制备

A. 血液标本

用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝, 不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠) 1-2ml,血液室温放置,8 小时内必须进行检测,否则需弃用。

B. PBMC(外周血单个核细胞)标本

1) 肝素抗凝管采集静脉血至少 2ml,采集后 4 小时内使用;

2) 加入等体积的 HBSS(Hank 平衡盐缓冲液,pH7.2-7.4)稀释血液;

3) 取与稀释后血液等体积的淋巴细胞分层液(Ficoll 液)加入离心管中;

4) 将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上,注意保持两者界面清晰;

5) 室温下,2000 r/min,离心 20 分钟;

6) 用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层,加入含有 5ml HBSS 的试管中,充分混匀;

7) 1500 r/min,离心 5 分钟,弃上清后,再洗一次;

8) 弃上清,用 RPMI 1640(含 10%热灭活 FBS)重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上);

9) 调节细胞浓度为 2 x 106 细胞/ml


2. 需要的试剂(以Multisciences Th17检测试剂盒为例)

Human——人Th17染色试剂盒/Human Th17 staining kit


 

Mouse——小鼠Th17染色试剂盒/ Mouse Th17 staining kit


3. 预实验检测刺激效果

1) 全血标本:取 250ul 全血标本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释到500ul;PBMC 标本:用 RPMI 1640(含 10%热灭活 FBS)重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);调节细胞浓度为 2 x 10^6 细胞/ml) ,取 500ul;

2) 在标本中加入 250× PMA/Ionomycin (Multisciences #CS1001) 2ul,混匀

3) 37℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 小时,期间注意相隔 1~2 小时混匀一次

4) 取 100ul 样本,加入 Human CD3(或 Mouse CD4)和 CD69 PE(用量详见说明书),室温孵育 20 分钟(全血样本溶血)后,用流式染色缓冲液(Multisciences #S1001)洗一遍,300g 离心 5 分钟,弃上清,用流式染色缓冲液重悬至 500ul,上机检测

5) CD3+(或 CD4+)细胞中,CD69 的阳性率应达到 90%以上,进行下一步正式实验


4. 正式实验:

1) 全血标本:取 250ul 全血标本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释到500ul;PBMC 标本:用 RPMI 1640(含 10%热灭活 FBS)重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);调节细胞浓度为 2 x 10^6 细胞/ml) ,取 500ul;

2) 在标本中加入 250× PMA/Ionomycin (Multisciences #CS1001) 2ul 和 250×

Monensin/BFA (Multisciences #CS1002) 2ul,混匀

3) 37℃,5% CO2 培养箱培养 4~6 小时,期间注意相隔 1~2 小时混匀一次

4) 检测样品管设置——Human

管 1:CD3 FITC/CD8α PerCP-Cy5.5/Mouse IgG1 PE

管 2:CD3 FITC/CD8α PerCP-Cy5.5/IL-17A PE

检测样品管设置——Mouse

管 1:CD3 FITC/CD4 PerCP-Cy5.5/Rat IgG2a PE

管 2:CD3 FITC/CD4 PerCP-Cy5.5/IL-17A PE

5) 每个样品做 2 管,分别加入 100ul 培养好的细胞或者全血,以及表面抗体(HumanCD3、CD8 抗体或 Mouse CD4 抗体,用量见说明书),4℃避光孵育 30min,不用洗

6) 加入 FIX&PERM Reagent A 100μl 室温孵育 15min

7) 加入 3ml 染色缓冲液(Multisciences #S1001),300g 离心 5min 弃上清收集细胞,液体尽量倒干净,不要残留

8) 涡旋,加入 FIX&PERM Reagent B 100μl 和 IL-17A 抗体(同型对照管加入同等剂量的抗体),混匀,4 度孵育 30min

9) 加入 3ml 染色缓冲液,300g 离心 5min 弃上清收集细胞

10) 用 0.5ml PBS 重悬后立即上机,或者加入 0.1%多聚甲醛 0.5ml 避光 4℃保存24小时内上机分析

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