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小鼠 Treg 试剂盒操作步骤

作者:联科生物    发布日期:2018-11-08 09:00


1. 在每个流式上样管中加入 100 µl 准备好的细胞悬液,细胞数约为 1x10^6 个。


2. 按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。按照说明书加入适量的 CD4 和 CD25 抗体。4 ℃孵育30 分钟。


3. 用预冷 PBS 洗涤细胞,离心去上清。


4. 用 3 倍体积的固定/破膜稀释液(#ICD01) 稀释 固定/破膜浓缩液(#ICC01),制成固定/破膜工作液,注意要新鲜配制,每管的用量为 1ml。


5. 旋涡震荡重悬细胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液(1:3 稀释好),并再次旋涡混匀。


6. 避光 4℃孵育 30 分钟。


7. 将破膜缓冲液(#ICB01)用去离子水 1:9 稀释,制成破膜缓冲液工作液。每管的用量为 8.5ml。


8. 加入 2ml 破膜缓冲液工作液(1:9 去离子水稀释),离心洗涤细胞并弃去上清液。


9. (可选)用 100ul 破膜缓冲液工作液重悬细胞,加入 2µl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified(#AM016)进行阻断,室温避光孵育 15 分钟。


10. 无需洗涤,加入 Foxp3 抗体或 PE Rat lgG2a 同型对照(用破膜缓冲液工作液进行稀释),避光 4℃孵育至少 30 分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。


11. 加入 2ml 破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。


12. 用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞,并上机检测并分析。


注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此 FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。


以上步骤仅供参考,以厂家说明书为准。

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