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小鼠 Treg 试剂盒操作步骤

作者:联科生物    发布日期:2019-10-18 08:00


【 操 作 步 骤 】


1、对于脾脏组织,采集新鲜样本后通过适当的方法制备成单细胞悬液,并去除团块,于当天进行检测。

2、在每个流式管中加入 100 µl 准备好的细胞悬液,细胞数约为 1x10^6 个。

3、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。按照说明书加入适量的CD4和CD25抗体(联科流式抗体用量一般是5ul)。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。室温避光孵育15分钟。

4、用2ml流式染色缓冲液洗涤细胞,离心去上清。

5、将Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent按1:3比例制备成1×工作液(Cat# IC001组分,联科生物)。在流式管中染色,每个样本需要1ml。保存勿超过1天。

6、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml 1×Fixation/Permeabilization 工作液,并再次旋涡混匀。室温避光孵育 30 - 60 分钟。

7、用蒸馏水将10×Permeabilization Buffer 稀释为1×工作液。在流式管中染色,每个样本需要8.5ml。剩余溶液在 2 - 8℃最多保存 1 周。

8、无需洗涤,每管加入2 ml 1× Permeabilization Buffer(Cat# IC001组分,联科生物)。室温下 300 - 400 × g 离心 5 分钟,弃去上清。

9、(可选)重复上一步操作。

10、用100μl 1×Permeabilization Buffer 重悬沉淀。通常洗涤后残留的液体量就已足够。

11、(可选)细胞悬液中加入2µl Anti-Mouse CD16/CD32 (2.4G2), Purified(Cat#AM016,联科生物)进行阻断,室温避光孵育 15 分钟。

12、无需洗涤,加入Foxp3 抗体或同型对照(用破膜缓冲液工作液进行稀释),室温避光孵育至少 30 分钟。

13、加入2ml 1×Permeabilization Buffer,室温下300 - 400 ×g离心5分钟,弃去上清。

14、(可选)重复上一步操作。

15、用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer(Cat#S1001,联科生物)重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此 FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。

 以上说明书仅供参考,具体实验请对照厂商说明书操作。


【 相 关 产 品 】

 
供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences 抗小鼠 CD4, FITC (克隆号:GK1.5) AM00401 50/100/250T
MultiSciences 抗小鼠 CD25, APC (克隆号:PC61.5) AM02505 50/100/250T
MultiSciences 抗小鼠 FoxP3, PE (克隆号:3G3) AM0F04 50/100/250T
MultiSciences 抗小鼠 CD16/CD32, 纯化 (克隆号:2.4G2) AM016 20/50/100μg
MultiSciences 小鼠 IgG1 同型对照, PE CMG104 10/20/50μg
MultiSciences 大鼠 IgG2b 同型对照, FITC CRG2b01 10/20/50μg
MultiSciences 大鼠 IgG1 同型对照, APC CRG105 10/20/50μg
MultiSciences FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit IC001 100T
MultiSciences 红细胞裂解液(不含固定剂)(10×) LYS 100/250/500T
MultiSciences 流式染色缓冲液 S1001 125 mL
MultiSciences 4% 多聚甲醛 F0001 100ml
Thermo Fisher 补偿调节微球 01-1111-41 25 tests

 

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