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抗体抗原实验该如何选择抗体?

作者:佚名    发布日期:2017-06-29 09:00

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,为缩小抗体的选择范围选中合 适的抗体,

需要考虑如下几种因素:

1. 分析或应用的类型

2. 样本蛋白的结构性质

3. 样本的种属

4. 抗体宿主的种类

5. 抗体的标记和检测


一、分析试验的应用类型

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型,如:可以应用于WB IHC ICC ELISA 分析等,如果抗体说明书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型,而仅是说明尚未经过此种分析试验验证,如果抗体不适用某些分析试验,则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。


二、 样本蛋白的结构性质

了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体,至少两方面因素需要考虑:

1. 待测样本蛋白的结构域:抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来,其中的免疫原包括:全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体(如:细菌)或细胞,抗体说明书一般都有免疫原的描述,如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域,则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS 流式检测活细胞的表面蛋白,则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。

2. 样本的提取或处理过程:某些抗体要求样本经过某些特殊处理,例如:许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本,另一方面,某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时,应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织,而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织,这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来。


三、样本的物种

应选择物种相同或有交叉反应的抗体,抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应,因其氨基酸序列同源性较高,如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中,并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白,而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过,应通过序列比对的方法来预测交叉反应,可应用Expasy 和 NCBI BLAST 来进行不同物种蛋白同源性比对。


四、一抗宿主物种的选择

一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要,对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,最好选兔源的一抗,则二抗则可选择偶联了检测分子(酶、荧光素、生物素等)的抗兔IgG。

如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况,除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法,则抗体宿主物种的影响不大,如对不含IgG 的细胞裂解物样本的western blotting检测,尽管如此,含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白,还原变性样本中含IgG,在western blot 检测中则结合出现IgG 分子50 and 25 kDa 的重链和轻链条带。


五、 二抗的选择

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建议检查二抗说明书确保该抗体适用于你的检测应用, 二抗一般连接荧光素FITC 或发光团。


六、双重染色抗体的选择

用未偶联一抗进行细胞培养物或组织切片的双重免疫染色要求一抗来源于不同物种并且二抗分别识别其中之一,二抗说明书应描述其与其它物种来源的免疫球蛋有否有交叉吸附。


七、荧光和化学发光标记

连接于二抗的标记物是为了检测抗体的结合,选择标记物依赖于几个参数:检测方法:荧光或着色沉淀,荧光标记物用特殊波长的光激发时发射出可见光,下表列出了几种荧光素的分子特征:

 
  荧光素
  颜色
  激发波
  发射波长
  分子量  
  Aminomethylcoumarin(AMCA)
  Blue
  353
  440
  410
  Fluoresein(FITC)
  Green
  495
  528
  390
  Fluorescein(DTAF)
  Green
  495
  528
  530
  Rhodamine(TRITC)
  Red
  550
  570
  444
  Texas Redtm
  Red
  596
  620
  625
  Cy2tm
  Green
  489
  505
  897
  Cy3tm
  Orange
  522
  565
  949
  Cy3.5tm
  Scarlet
  581
  596
  1286
  Cy5tm
  Far-Red
  650
  667
  975  
  Cy5.5tm
  Near Infra-Red
  678
  703
  1312
  Cy7tm
  Near Infra-Red
  743
  767 
  1001
  R-Phycoerythrin(RPE)
  Red
  488
  575
  240000
  B-Phycoerythrin(BPE)
  Red
  545
  575
  240000
  C-Phycocyanin
  Red
  618
  640
  110000
  R-Phycocyanin
  Red
  615
  620
  110000


二抗连接标记酶HRP and AP 与其底物产生有颜色的沉淀物
 

辣根过氧化物酶
Horseradish peroxidase(HRP)
碱性磷酸酶
Alkaline phosphatase(AP)
AEC(red)
Fast red(pink)
DAB(brown)
INT(yellow/brown)
 
NBT(brow/purple)
 
New Fuchsin(red)
 
TNBT(purple)
 
Vega red(pink)


封片介质(仅免疫组化),AEC、Fast Red、INT 或其它水性发光基团是可以醇溶的并要求水性封片。除上述之外的发光基团是有机的所以最好使用有机性封片介质。


荧光素标记物要求水性封片介质,藻红蛋白(藻青素 / 藻红素要求不添加甘油的水性封片介质,因其有淬灭荧光的效应。


生物素化的抗体通常用于加强亲和素-生物素-酶或荧光素复合物(ABC 试剂 或亲和素或链霉亲和素连接酶或荧光素的信号)

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