还在Th17检测中挣扎,这份攻略治愈你

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作者:小科 发布日期:2021-08-30 09:00

通常所说的Th17是指在各种生理与病理条件下有能力分化为Th17的辅助性T细胞 (严格意义上是Th0)。当受到外界因素(如刺激素、病原体等)刺激,Th0即会向Th1、Th2、Th17等Th细胞分化,此时,通过检测分泌的细胞因子(如IFN-γ、IL-4、IL-17等)实现对各类Th细胞的检测。

Th17:主要分泌IL-17、IL-22等促炎因子,介导自身免疫性疾病和炎症反应。

考虑到静息状态下Th0分化为Th1、Th2、Th17等的能力非常弱及流式细胞仪无法检测分泌到细胞外的细胞因子等因素,检测Th细胞时需要添加刺激剂及阻断剂。

我们通常选用的刺激剂为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素),也有人选用CD3/CD28协同刺激、PHA刺激等来活化T细胞。实验表明,PMA为广谱性刺激,即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活,而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激,则是通过TCR受体的作用,仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素 A)和/或 Monensin (莫能霉素),通过破坏高尔基体来切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。

另外,实验过程中涉及到如何正确的选定Th(即T辅助细胞)的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+,而当用PMA刺激4小时时,会发现CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞,即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。(注:PMA对小鼠CD4的影响很小,所以检测小鼠Th17时可用CD4直接设门)。

Th17 检 测 步 骤 如 下
样 本 制 备

• 全血标本

用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝,不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠)1-2ml,血液室温或4℃放置,8小时内必须进行检测,否则需弃用。• 外周血单个核细胞(PBMC)标本

1. 对于使用其它抗凝剂(如EDTA或枸橼酸钠)抗凝血,采集静脉血至少1ml,采集后4小时内使用;

2. 加入等体积的Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水稀释血液;

3. 取1ml淋巴细胞分离液加入离心管中;

4. 将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上,注意保持两者界面清晰;

5. 室温下,1500r/min,离心15分钟;

6. 用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层,加入含有4-5ml Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水的试管中,充分混匀;

7. 1500r/min,离心10分钟,弃上清后,再洗一次;

8. 弃上清,用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);

9. 调节细胞浓度为1x107细胞/ml。

刺激效果检测(选做)

1. 全血标本:取125μl抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基稀释到250μl;PBMC标本:用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);调节细胞浓度为1×107/ml,取250μl;

2. 在标本中加入1 μl250×PMA/Ionomycin,混匀;

3. 37℃,5%CO2培养箱培养4~6小时,期间注意相隔1~2小时混匀一次;

4. 取100μl样本,加入Human CD3(或 Mouse CD4)和CD69PE(用量详见说明书),室温孵育20分钟(全血样本溶血)后,用流式染色缓冲液洗一遍,300g离心5分钟,弃上清,用流式染色缓冲液重悬至500μl,上机检测;

5. CD3+(或CD4+)细胞中,CD69的阳性率应达到90%以上,进行下一步正式实验。

正式实验

1a. 全血标本:取125 μl抗凝血至流式管中,加入125 μl不含血清的培养基和1 μl PMA/Ionomycin Mixture(250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture(250×)。取125 μl抗凝血和125 μl不含血清的培养基,作为对照。混匀,37℃孵育4-6小时,每隔1-2小时取出震荡混匀;

1b. PBMC标本:用含10%胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,使细胞浓度为1×107/ml。取250 μl PBMCs至流式管中,加入1 μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1 μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs的样本作为对照。混匀,37℃孵育4-6小时,每隔1-2小时取出震荡混匀;

注:PMA/Ionomycin Mixture (250×)和 BFA/Monensin Mixture (250×)极易挥发,使用后请及时旋紧管盖。

2. 从样本管和对照管中取100 μl细胞悬液至新的流式管中,加入5 μl Anti-Human CD3, FITC 和5 μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5(或加入5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5)。震荡混匀,室温避光孵育15分钟;

3. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium A,震荡混匀,室温避光孵育15分钟;

4. 用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×,每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 g离心5分钟,弃上清;

注:液体尽量倒干净,不要有残留。

5. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium B和5 μl Anti-Human IL-17A, PE(或5 μl Anti-Mouse IL-17A, PE)。震荡混匀,室温避光孵育15分钟;

6. 每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 g离心5分钟,弃上清;

7. 每管加入500 μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬,上机检测;或者加入500 μl 1-4 %多聚甲醛重悬,2-8℃避光,于24小时内检测。

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目录号 产品名称 规格型号
70-KTH217 Mouse Th17 staining kit 小鼠辅助性Th17细胞检测试剂盒 25T/100T
70-KTH117 Human Th17 staining kit人Th17染色试剂盒 25T/100T
70-KTH001 Human Th1/Th2/Th17 staining kit 人Th1/Th2/Th17 染色试剂盒 25T/100T

结果示例

使用 Mouse Th17 Staining Kit 进行流式检测。正常 ICR 小鼠的静息肝素抗凝血(A0)、EDTA 抗凝血来源的 PBMCs (B0)、脾细胞(C0)和脾单个核细胞(D0)染色 IL-17A。正常 ICR 小鼠的 PMA/Ionomycin刺激的肝素抗凝血(A1)、EDTA 抗凝血来源的 PBMC(B1) 脾细胞(C1)和脾单个核细胞(D1)染色 IL-17A。对CD3+/CD4+细胞进行设门分析。