流式常见问题与解决措施
流式常见问题与解决措施
主要是根据检测样本是否带荧光和细胞是否是贴壁细胞两个角度考虑：
- 若是表达\转染了GFP(绿色荧光蛋白)或YFP(黄色荧光蛋白)的细胞样本，推荐AP105，若是其他荧光需提供该荧光流式检测的通道或最大激发波长和最大发射波长信息，具体问题具体分析；
- 如果是贴壁细胞，推荐AT系列凋亡试剂盒，该系列试剂盒包含了Accutase酶，可温和消化细胞。
试剂盒中每个组分均是液体；染料组分Annexin V 1T需要5ul，PI/7-AAD 1T需要10ul；10T代表可以染10个样本。若准备做空白单染管调荧光补偿的话，染料组分Annexin V和PI/7-AAD至少要消耗1T的量。
这两种方式检测的实验结果理论上应该没多大差别，操作者可以根据自己的实验的时间安排来具体选择。但也不排除有些样本比较特殊，固定的时候对细胞的整体状态影响较大，这种情况下选择活细胞检测的方式会更好一些。
为了方便客户的实验安排，公司研发了用于周期实验的破膜溶液，可以在细胞上打孔，让PI染料进入，从而对细胞核进行染色。
此两者虽都是PI染料，但因工作浓度不同，不能通用，否则会影响实验效果。
试剂盒中配的是Foxp3这个抗体对应的同型对照抗体，因为Foxp3本身正常情况下的表达量很低，实验操作中设置了对应的同型对照样本，就可以排除非特异性结合。
不需要，试剂盒中配的固定破膜剂中的固定破膜剂B兼顾了裂红的作用，所以无需额外的裂红处理。
具体需要准备如下的空白和单染管样本用于调补偿
- 收集带GFP荧光的细胞+等量的不带任何荧光的细胞，不用加任何试剂，作为GFP单染管。
- 不带任何荧光的细胞用试剂盒里的仪器参数调节步骤制成7-AAD单染管和APC单染管，以及空白对照管。
- 流式上机的时候确定好荧光通道的电压之后，可以进行两两荧光之间的补偿调节。
理论上只要荧光通道不重叠可以一起用的。
细胞凋亡的检测需要立即上机的，时间越久，会增加细胞的损伤，造成染色的假阳性增多；如果流式上机地点距离实验室较远，建议将未处理的细胞直接拿过去处理，染色后尽快上机。
不建议用PI作为细胞周期染料的试剂盒进行实验，因为荧光与PI有干扰，无法得到准确及好看的细胞周期结果，带GFP的可以建议用7-AAD或者其他蓝光进行实验，如DAPI或Hochst染料，红色荧光只能用蓝色荧光的进行周期检测，联科没有其他染料的周期试剂盒，实验需要根据不同样本进行预实验摸索最佳浓度。
一般说的同型对照就是样本标记同型对照抗体管，同型对照（Isotype）抗体使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。所以建议胞内染色且表达量角度的指标最好做同型对照，表面染色可根抗体分群情况设置，阴阳性细胞只有一群最好设置同型对照。 产品选择：查找目的蛋白的抗体来源种属、亚型及荧光标记，对应选择同型对照抗体就可以；例如Anti-Mouse CD3ε, FITC (Clone:145-2C11) 流式抗体，抗体来源：Armenian Hamster IgG，带有FITC荧光（可在说明书中查询），同型对照选择：Armenian Hamster IgG Isotype Control, FITC。
