Treg/Th17流式实验小白Q&A

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辅助性T淋巴细胞17(T-helper 17,Th17)及调节性T淋巴细胞(regulatory T lymphocyte,Treg)属于CD4+ T细胞,它们在免疫反应中具有重要作用,Treg细胞具有免疫抑制作用,Th17细胞在宿主防御细胞外病原体中发挥促进作用。研究发现免疫促进性的Th17细胞和免疫抑制性的Treg细胞之间存在一种平衡,一旦平衡被破坏,将有可能引起自身免疫性疾病,因此在进行自身免疫性疾病相关研究时,经常会检测Th17细胞和Treg细胞水平,常用流式方法检测。

DOI: 10.3390/molecules22010134

对于流式小白来说直接选择Th17 细胞和Treg 细胞流式检测试剂盒是个方便、高效的好方法。不过即使有试剂盒,实际操作时因为流式实验知识基础较薄弱,多少会有些疑问,下面收集了一些使用联科的Th17 和Treg试剂盒常见的问题和相关的解决方法,以便大家更好地完成Treg/Th17流式实验。

PART 01 样本管设计

Q1:我有好几组样本,分批做实验,单染管和空白管是否每批实验都要做?第一次实验的荧光补偿调节可以做后面实验的荧光补偿调节吗?
A1:如果分批实验是在2个月内完成,此外用的是同样的试剂、同样类型的样本以及同一台流式仪器的话,第一次实验的单染和空白管的荧光调节数据可应用于后面的实验的荧光补偿调节。为保证实验结果的准确性,建议最好分批做实验,有条件的话至少做3次实验。

Q2:空白管是只有细胞样本,不加任何抗体吗?单染管是只染一个荧光标记抗体?那空白管和单染管的实验操作步骤是不是和说明书上的样本一样呢?
A2:是的,空白管是只有细胞样本,不加任何抗体;单染管是只染一个荧光标记抗体。操作可以按照说明书中样本管一样的操作,只是注意空白管不加任何抗体,单染管只加一个荧光标记抗体,其余的步骤是一样的。

Q3:实验目前有实验管,空白管,单染对照管,说明书上的同型对照管是啥?
A3:

实验管:按照说明书操作,所有抗体都染的管;

空白管:只含有样本,不染任何抗体的管;

单染管:含样本,只染一个荧光标记的抗体;

对照管:Th17有个未刺激的对照管,就是样本准备前期不加刺激阻断剂,后面的操作和实验组样本一样的管;

同型对照管:需要染同型对照抗体的管,主要是Treg实验中要设置同型对照管,就是染Foxp3抗体前的步骤和实验组一样,到染Foxp3抗体这一步,同型对照管加的是Foxp3的同型对照抗体(小鼠 IgG1 同型对照, PE)。

PART 02 样本检测

Q1:打算再测一个试剂盒里没有的抗体CD8,和Treg实验一起做,具体操作时怎么一起的,是和CD4和CD25一起加入吗?
A1:是和CD4和CD25一起加入。CD8是表染抗体,CD4和CD25也是表染抗体,表染抗体应该一起染,比胞内和核内抗体先染。

Q2:不能马上上机检测的话,是只加多聚甲醛,不用再加流式染色缓冲液吗?Treg说明书上没写可以加多聚甲醛,也是一样的吗?
A2:不能马上上机检测的话,到用500 μL的1× Flow Cytometry Staining Buffer 重悬这一步改换加入500 μL浓度为1 - 4 %的多聚甲醛重悬,2 - 8℃避光,于24小时内检测。Treg和Th17的操作是一样的,不过建议尽量当天检测,相对而言当天检测的实验效果更好。

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产品部分引用文献

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