流式细胞技术应用进展讲座

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http://www.liankebio.com/article-information_Tech-1561.html

作者:联科生物 发布日期:2006-10-11 12:00

多色分析荧光素首选----Alexa Fluor 荧光染料
? 亮度(Brightness) --- 高

? 光稳定性(Photostability) --- 强

? pH --- 不敏感
早期凋亡检测--- Annexin V/PI存在的问题
? 贴壁细胞–胰酶消化破坏Annexin V结合位点

? 需高钙离子的结合缓冲液

? 需洗涤步骤
解决的方法YO-PRO-1/PI
? 特别适合贴壁细胞检测–与Annexin V/PI检测相关性极

? 无需特殊的结合缓冲液

? 无洗涤步骤

DNA含量分析新宠DyeCycle——标本直接染色!30分钟即可上机检测!

  Vybrant DyeCycle DRAQ5 PI(碘化丙啶)
生产商 Molecular Probes Biostatus 多家
膜通透性 通透,染色活细胞 通透 不通透
细胞毒 无毒性,可分选、再培养 毒性大 细胞已死亡
激光器 488nm 633/635nm 488nm
检测通道 FL1或FL2 FL3(FC500), FL4(BD) FL2和FL3
操作 简单、快速 简单、快速 需固定,复杂,耗时长
价格 适中 昂贵 便宜或适中

活细胞/死亡细胞鉴别——SYTOX替代PI ,用于多色分析!

LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kits SYTOX PI(碘化丙啶) 7-AAD
生产商 Molecular Probes Molecular Probes 多家 多家
染色后固定 可以,能延迟分析 不能 不能 不能
生物危害性
检测通道 FL1或FL3 FL1,FL2, FL3(FC500), FL4(BD) FL2和FL3 FL3(FC500), FL4(BD)
激光器 UV, 405nm 或488nm 405nm, 488nm, 532nm 或633nm 488nm 633nm
存在的问题 多通道检测, 不适合多色分析 分群不好

CFSE细胞示踪技术
原理:

CFSE存留于细胞整个发育和有丝分裂过程中,可用于体内(in vivo)和体外(in vitro)的细胞示踪。

特点:

? 目前应用范围最广的细胞示踪试剂

? 为流式细胞术检测调试

? 示踪时间长:

标记有CFSE的淋巴细胞注射入小鼠后,8周之内均可检测到CFSE[1];

小鼠活的肝细胞标记CFSE,肝内移植20天后仍可检测到CFSE[2] [1] J Immnol Methods. 1990, 133: 87

[2 ] Transplant Proc. 1992, 24: 2820

细胞增殖研究 CFSE Cell Proliferation Kit

? 细胞分裂次数

? 多参数分析-同时标记其它表面或内部分子,以分析各细胞分裂相抗原的表达情况。

Ca2+测定

产品名称 激发波长(nm) 发射波长(nm) Ca2+升高时的发射变化 备 注
Ratiometric dyes (比率法测定染料)
Indo-1 UV 401/475 比率改变 经典的Ca2+染料,需UV激发
Fluo-3/Fura Red 488 530/660 比率改变  
Non-Ratiometric dyes(非比率法测定染料)
Fluo-3 488 526 升高 经典的Ca2+染料,结合Ca2+后荧光强度高强。
Fluo-4 488 516 升高 Fluo-3的类似物,2个氯基团被氟取代,488nm激发增强。
Calcium Green-1 488 530 升高 结构与Fluo-3相似,低Ca2+浓度时荧光更强,适于检测基准水平和静止细胞。
Orange Green 488BAPTA-1 488 523 升高 Calcium Green的类似物,氯基团被氟取代,荧光强度高于Fluo-3和Calcium Green。
Fura Red 488 597 降低 Stroke’s位移大,将组织和生物液体中自发荧光和色素的干扰降至最低。

氧化爆发(Oxidative Burst)
吞噬细胞(单核和中性粒细胞)在进行氧依赖性杀菌过程中,会激活细胞膜上的还原型辅酶I (NADH氧化酶)和还原型辅酶II (NADPH氧化酶) ,使分子氧化,生成大量的活性氧簇 (reactive oxygen species,ROS),包括过氧化氢和氧离子自由基等,这些物质具有很强的氧化作用和细胞毒作用,能有效地杀伤病原微生物。

HDCFA: (dichlorodihydrofluorescein diacetate) (二氯双氢荧光素二乙酸酯)

? 需细胞内酯酶酯解,适合检测粒细胞

Fc OxyBurst:

? 无需细胞内酯酶酯解,

? 适合检测单核细胞和粒细胞

HDCFA:? 受ROS从吞噬体向胞质弥散速度的限制

Fc OxyBurst:? 直接检测内吞及吞噬体内的氧化爆发

BacLightTM Bacterial Stains 细菌死活鉴别
? 非核酸标记的荧光试剂,流式细胞术检测。

? 快速:15min

? 免洗

? 多参数分析:核酸探针、Lectin标记物和标记抗体等

BacLightTM RedoxSensorTM Green 细菌活力检测
原理:? RedoxSensorTM Green试剂,在细菌还原酶(Reductase)的作用下形成稳定的绿色荧光信号,是反映细菌活力的敏感指标。

应用:? 细菌药敏试验

? 发酵罐中细菌的活力

特点:? 快速:10min

? 含PI(碘化丙啶),用于鉴别死细胞

? 含G+和G-细菌的阴性质控试剂CCCP (碳酰氰基-对-氯苯腙)和叠氮钠

BacLightTM Bacterial Membrane Potential 细菌膜电位检测
? 荧光染料 — DiOC2(3),绿色

? 膜电位正常(健康细菌) -- DiOC2(3)聚集,荧光红移

? 膜电位变化 – 红/绿荧光比率

FluoReporter® LacZ Flow Cytometry Kit 报告基因检测
传统的X-Gal比色检测法敏感度低,常需要大量细胞提取物以获得足够强的信号

FluoReporter® LacZ 流式试剂盒

1) 专利的低渗技术负载FDG底物

2) 非常敏感地检测单细胞水平的β-半乳糖苷酶活性

3) 可分选和克隆β-半乳糖苷酶阳性的细胞