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作者：佚名 发布日期：2017-07-17 09:00
1.在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的 RNA 酶，以防止 RNA 降解。 1）用含离液（如胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆； 2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令 RNA 酶失活； 3）立即将样品置于 RNAlater：RNA Stabilization Reagent QIAGEN（联科生物代理）。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的 RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（<0.5 cm），这样 RNAlater 才能在 RNase 破坏 RNA 之前迅速渗入组织块中。 2.使用正确的细胞或组织储存条件 在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致 RNA 的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。 RNAlater 使样品储存更为便利。储存在 RNAlater 中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达 1 个星期，在 4°C可稳定保存长达 1 个月，或永久保存在-20°C。 3.彻底匀浆样品 细胞或组织的彻底匀浆对 RNA 提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止 RNA 的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和 RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型，哪些方法是最适合的匀浆方法，请参考 联科生物 4.在 RNA 提取之前预处理样品裂解液 对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA 提取之前，还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高 RNA 产量。 5.选择最好的 RNA 分离方法 现有众多的 RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）的样品，就推荐使用更加严格的、基于酚处理的 RNA分离方法。 6.DNase 处理 如果提取的 RNA 将用于 RT-PCR，我们推荐用 DNase 处理纯化的 RNA 样品以去除残留的 DNA 污染。洗脱之前加步DNase消化步骤。 7.减少环境 RNase 的暴露 为了得到完整的、高品质 RNA，在整个 RNA 制备过程中，当 RNA 离开强蛋白变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的 RNase 污染就非常关键。由于 RNase 几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的 RNA接触的每一样东西都是无 RNase 污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如DEPC 处理过。必须保证一直使用无 RNase 的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。 8.正确的沉淀 纯化得到的 RNA 可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。联科生物RNA提取试剂盒与纯化柱离心技术相结合。与传统的 RNA 分离技术不同，该柱无需乙醇沉淀、无需昂贵的树脂、 无需有害的有机试剂如酚、氯等，且可同时操作多个样本。RNA 结合在硅胶膜上，溶解的蛋白与 PCR 抑制物则被过滤除去，得到RNA直接用于下游实验。 9.重悬 许多 RNA 提取步骤的最后一步是溶解纯化的 RNA 沉淀。理想的重悬溶液应该满足 3 点要求：无 RNase 污染、较低的 pH 值（pH 6-7）、含有螯合剂，以保护 RNA 不受带入的 RNase 的降解。联科生物RNA提取试剂盒包含洗脱液，洗脱得到的RNA直接用于下游实验。 10.储存 如果只是短期储存，重悬的 RNA 应放置于-20°C；如果是长期储存的话，就应该放置于-80°C。 联科生物 第1期RNA提取相关试剂盒 欢迎选购
以上文章 原文来自丁香园-如何改善RNA提取质量 |
