流式细胞术知识分享 — 试剂篇

在流式细胞术中会使用多种荧光试剂，包括荧光偶联抗体、DNA结合染料、活性染料、离子指示剂染料和荧光蛋白。

在过去的几年里，由于相关试剂种类和数量的增加，用于流式细胞术实验的参数数量发生了爆炸性增长。比如，用于偶联单克隆抗体的荧光染料，如串联染料和聚合物染料的数量急剧增加。此外，除了GFP之外，可用于转染的荧光蛋白也有所增加，如mCherry、mBanana、mOrange、mNeptune等。本文就为大家介绍一下常用的流式荧光试剂。

有机小分子

有机小分子如荧光素(MW=389 D)、Alexa Fluor 488(荧光素类似物)、Texas Red (325 D)、Alexa Fluor 647 (1464 D)、Pacific Blue和Cy5 (762 D)通常用于抗体偶联。它们具有一致的发射光谱，但有一个小的Stokes位移(激发波长和发射波长之间的差，约50-100 nm)。有机小分子很稳定，且很容易与抗体结合。目前，一些染料（例如Alexa Fluor, Thermo Fisher）经过特殊设计，可减小成像时的光漂白效应，是样品需要成像分析时更好的试剂选择。

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藻胆蛋白

藻胆蛋白是来源于蓝藻、鞭毛藻等藻类的大型蛋白质分子。藻胆蛋白的分子量大（例如藻红素(PE)的分子量为240kD），非常适合于定量流式细胞术，因为它们在偶联过程中通常有1:1的蛋白质与荧光色素比例。藻胆蛋白具有较大的Stokes位移(75-200 nm)和稳定的发射光谱。然而，藻胆蛋白易受光漂白效应影响，不建议长时间或反复暴露于激发光源。常用的藻胆蛋白有藻红蛋白(PE)，藻蓝蛋白(APC)和叶绿素蛋白(PerCP)等。

藻红素及其辅因子结构示意图
藻红素及其辅因子结构示意图

量子点

量子点 (Qdots) 是半导体纳米晶体，具有与纳米晶体尺寸相关的紧密荧光发射光谱。它们最适合用紫外或紫色激光激发，但也可能被多个激光最低限度地激发。当 Qdots 用于多参数实验时，这种最小激发使荧光补偿复杂化。由于补偿问题和难以结合抗体，Qdots在多参数染色面板中已在很大程度上被聚合物染料取代。

高分子聚合物染料

聚合物染料由收集光信号的聚合物链组成，可以根据聚合物链的长度和连接的分子亚基，吸收和发射特定波长的光。聚合物染料非常稳定，具有与藻胆蛋白相似的量子效率，且光稳定性大大提高。由于聚合物染料只能吸收特定波长的光，因此避免了量子点试剂在多参数实验中难以进行多次激光激发的问题。常见的聚合物染料有亮紫(BV)、亮紫外(BUV)和亮蓝(BB)试剂。

串联染料

串联染料由藻胆蛋白（PE、APC、PerCP）或聚合物染料（BV421、BUV395）与小的有机荧光染料（Cy3、Cy5、Cy7）化学偶联而成，可用单个激光源进行激发，这种染料增加了可由单个激光激发的荧光染料的种类。例如，Texas Red的最大激发波长为589 nm，PE的发射波长为585 nm，因此通过将PE偶联到Texas Red， PE的发射光通过荧光能量转移（FRET）激发Texas Red，使PE-TxRed串联染料可以被488 nm或532 nm激光激发。聚合物链抗体使用相同的方法来增加可由单个激光激发的荧光染料。串联染料非常明亮，具有较大的Stokes位移值 (150-300 nm)，这在处理低抗原密度样本时非常有用。

然而，串联染料的稳定性不如供体荧光染料，而且它们的能量转移效率因批次而异，使补偿变得复杂。大多数较长的Brilliant聚合物染料也是串联的，也存在上述问题。

串联染料工作原理示意图
串联染料工作原理示意图

用于细胞计数的金属偶联物

金属偶联物由用于质谱流式细胞术的抗体与镧系元素中的单一同位素重金属离子结合产生。目前，有35种镧系元素同位素可用于抗体偶联。这种偶联物是非荧光的，仅适用于质谱流式细胞术。

荧光蛋白

荧光蛋白常被用作基因表达的报告系统，最常用的是从水母中提取的绿色荧光蛋白(GFP)。研究者们对GFP进行克隆，获得了青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。红色荧光蛋白(DsRed)被发现于蘑菇海葵中，并被成功地应用于荧光报告系统。新一代荧光蛋白(mCherry, mBanana)由DsRed克隆得到，具有更宽的激发光谱和发射光谱。在流式细胞术中，紫色、绿色和黄色激发的荧光蛋白应用尤其广泛。

新的荧光蛋白不断被发现和生成，目前已有数百种，为流式细胞术使用者们提供了更多样化的选择方案。

核酸染料

核酸染料可以结合DNA和RNA。它们可用于定量 DNA以进行细胞周期分析（碘化丙啶、7AAD、DyeCycle Violet、DAPI）、区分染色体以进行分选（Hoescht 33342、Chromomycin A3）、进行侧群分析和细胞活力分析（Hoescht 33342）以分选干细胞、分选细菌等。

增殖染料

增殖染料可用来测定细胞增殖。羧基荧光素琥珀酰酯(carboxyfluoroscin succinim酯，CFSE)和其他类似染料可用于跟踪增殖细胞的多次分裂。每个细胞都会被染料永久标记，但由于染料的稀释，后代细胞中的染料量会降低。这些染料不影响细胞的生长和形态，适合长期的增殖研究。

细胞活性染料

细胞活性可以通过排除染料（碘化丙啶，DAPI）染色来测定，或通过一些胺结合染料与细胞内的胺结合，以确定细胞膜是否完整来测定。不能固定的排除染料仅适用于非传染性细胞，且需要立即进行分析。胺结合染料能够固定细胞，可用于传染性细胞、内部抗原需要染色的细胞以及在实验前需要储存的细胞。

钙指示剂染料

钙指示剂染料与钙结合时会发生颜色转移，被用来指示细胞的激活和信号传导。根据染料与钙结合与否，检测结果呈现为两种波长的比值。最常用的钙指示剂染料是紫外双相钙探针——indo-1。此外，蓝绿色的钙探针也已经得到应用。