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Western Blot 常见问题分析Western Blot 常见问题分析(一)

作者:联科生物    发布日期:2020-03-23 09:00



Western Blot,通常我们在日常交流中说的就是简称“WB”,中文名称是“蛋白印迹”或“免疫印迹”,其核心本质是抗原抗体的特异性反应。Western Blot的基本原理是蛋白质通过凝胶电泳后,按分子量大小顺序在分离胶中分离开来,通过转膜可将胶上蛋白质转移到固相载体(通常是PVDF膜、NC膜和尼龙膜)表面,然后加入一抗去特异性结合膜上蛋白质,再加入酶或者荧光素标记的二抗,二抗与一抗结合反应后,通过底物显色、化学发光等方法检测目的蛋白。Western Blot实验一般用来判断特定蛋白在样本中是否表达及粗略分析特定蛋白表达量的高低。



Western Blot是实验室中常见且重要的一种分子生物学实验方法,一次完整的实验一般需要两天时间,当我们对实验结果满怀期待or充满信心,也许现实会给我们一记响亮的耳光。
 



下面,小科整理了一些Western Blot 结果常见问题:


/   条 带 弱   / 

 


原因分析1:抗原量不足;

解决方案1:上样前做蛋白定量,增大上样量;

蛋白定量的意义:保证各处理组总蛋白上样量一致,蛋白总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定,蛋白含量太高会使条带扭曲,影响电泳的分辨力;


原因分析2:蛋白质储存过程中降解;

解决方案2:重新制备样品;


原因分析3:膜错误选择,转膜不完全;

解决方案3:选择合适的转印膜:大蛋白(>20KDa)选大孔膜(0.45μm),小蛋白(<20KDa)选小孔膜(0.2μm);优化转膜条件、时间、电压。

转膜中的要点和建议

转膜具体情况 要点和建议
  大分子量蛋白   1)大的蛋白倾向于在胶里沉淀,阻碍转移。在转膜缓冲液里加入0.1%的SDS有助于解除上述现象;
  2)甲醇倾向于从蛋白上移除SDS,因此把甲醇浓度降到10%甚至更少,有助于减少上述沉淀现象,
  适用于大分子量蛋白转膜;
  3)用4℃湿转过夜代替半干法转膜。
  小分子量蛋白   1)SDS阻碍蛋白和膜的结合,但小分子量蛋白受到的影响更大。若转膜的蛋白很小,可以考虑去掉
  缓冲液里的SDS;
  2)保持甲醇浓度在20%;
  3)对于非常小的蛋白,不要用半干法。
  膜的方向确定   转移后剪角做标记,分清正反面;用铅笔做记号或电泳时Marker上成非对称的。
  转膜后背景高   选择NC膜;另外,鸡的抗体倾向于和PVDF膜及一些尼龙膜结合而导致高背景;可以换成NC膜以减
  少背景。
  转膜时污染   避免手指触碰膜,可以用镊子来取膜。手指上的油脂和蛋白质会阻碍有效的转膜,也会弄脏杂交。
  滤纸的大小   确保滤纸和膜的大小与胶一致。当使用半干法转膜时,过多的部分会阻碍电流穿过膜。

原因分析4:抗体量不足;

解决方案4:增加抗体浓度,注意抗体储存条件(避免反复冻融);

抗体的保存和使用:

1 收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存;

2 对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

    2.1 分装的量以一次实验用为好,最好不能少于10ul每份,因为分装体积越小,抗体的浓度越可能受到蒸发及管壁吸附的影响;

    2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来;

3 大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

任何时候,绝对避免反复冻融。


原因分析5:抗体孵育时间不足;

解决方案5:建议一抗4度孵育过夜;相对于2小时孵育,一抗4度过夜孵育会显著增加抗体的结合。


/   条 带 弯 曲  /   
 

原因分析1:条带向上弯曲(︶ 条带呈笑脸状):凝胶制备不均匀,中间冷却不好;
解决方案1:
分离胶配好后用水压线,保证水平,配胶缓冲液现用现配,混合均匀后制胶。

原因分析2:条带向下弯曲(︵ 条带呈皱眉状):可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡;
解决方案2:制胶架装配好后,用水检查是否有空隙再灌胶。
原因分析3:条带显示不均匀,中空:可能凝固太快导致聚合不均匀;
解决方案3:使用合适的促凝剂,制胶液混合好后及时灌胶


/   弥 散  /   

原因分析1:加样过量;
解决方案1:降低上样量,推荐每孔上样20-30ug。
 

原因分析4:电极不平衡,加样位置偏斜;
解决方案4:电泳槽水平放置,配胶时尽量小心,确保每个加样孔完好无损。
原因分析2:蛋白降解;
解决方案2:使用蛋白酶抑制剂。
 
原因分析3: 样品溶解不好;
解决方案3:样品制备中一定要充分匀浆并超声裂解。
 

原因分析5:样品中含有不可溶颗粒;
解决方案5:缓冲液配好后过滤除菌,样品裂解保证可溶性

更多实验常见问题留待下次讨论,敬请期待。

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