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成熟 T 细胞通过 TCR 识别并与抗原-MHC 复合物反应。TCR 活化的最直接后果是信号通路的起始，这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶（PTKs）、PIP2 分解、PKC 活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核，产生诸多效应：
- T 细胞克隆的扩增
- 细胞表面活化标志的上调
- 分化成效应性细胞
- 诱导细胞毒或细胞因子的分泌
- 诱导凋亡
最常用的体外刺激检测 T 细胞增殖的方法是用 TCR 的抗原或竞争性抗体活化 T 细胞。本 protocol 是一个基本方法，用 CD3 体外刺激小鼠脾 T细胞和人类外周血 T 细胞的增殖。
一、小鼠脾脏：
材料
- 1X 无 菌 PBS
- Anti-Mouse CD3ε, Functional Grade (Clone:145-2C11) (Multiscience, Cat:F2100300)
- Anti-Mouse CD28, Functional Grade (Clone:37.51)（Multiscienc, Cat: F2102800）
- RPMI-1640 完全培养基
- 无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液
- 96 孔平底带盖微孔板
- 刀豆蛋白 A，可选
仪器用具
- 微量移液器或排枪离心机
- 37°C, CO2 培养箱
实验时间
2 小时包被抗体
20 分钟制备脾脏单细胞悬液
20 分钟分析设置
2-4 天孵育
实验步骤
抗体包被至微孔板：
1、 用无菌 PBS 制备 5-10µg/ml 的 anti-CD3e (145-2C11)抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品做复孔。例如，包被半张板需要 2.6ml 抗体溶液(48孔板)。若用其他抗体共刺激时，CD3 抗体的浓度可以降低。
2、 96孔板中，每孔加入 50μl 抗体，空白对照孔加 50μl 无菌 PBS。
3、 用 ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育 2 小时或 4℃过夜。
4、 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。
5、 每孔用 200μl 无菌 PBS 洗后，弃去 PBS。
6、 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。
加细胞：
1、 取脾脏，无菌制备单细胞悬液。溶血去除红细胞。
2、 计数细胞并重悬于RPMI-1640 完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。
3、 洗板结束后，每孔加 200μl 细胞悬液，置于潮湿的 37°C, 5% CO2 培养箱中。可选择加刺激对照：ConA 1-4µg/ml 刺激后孵育。
4、 加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。
5、 孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。
6、 收获细胞，继续其他方面的实验检测。
活化效果流式验证方案
小鼠原代脾脏T细胞体外活化流式法验证
| 表面标记 | 荧光通道 | 克隆号 | 检测功能 | 产品货号 |
| CD3 | PerCP-Cy5.5 | 145-2C11 | 总T细胞圈门（骨架标记） | F2100304 |
| CD4 | FITC | GK1.5 | 辅助性T细胞亚群分型 | F2100401 |
| CD8 | APC-Cy7 | 53-6.7 | 细胞毒性T细胞亚群分型 | F2100806 |
| CD69 | PE | H1.2F3 | T细胞早期活化（4 h峰值） | F2106902 |
| CD25 | APC | PC61.5 | T细胞中期活化（24 h稳定表达） | F2102503 |
二、 人PBMCs:
材料
- 1X 无 菌PBS
- Anti-Human CD3, Functional Grade (Clone:OKT3) （Multiscience, Cat: F1100300）
- Anti-Human CD28, Functional Grade (Clone:CD28.2) （Multiscience, Cat: F1102800）
- RPMI-1640 完全培养基
- 无菌的人PBMCs
- 96 孔平底带盖微孔板
仪器用具
- 微量移液器或排枪离心机
- 37°C, CO2 培养箱
实验时间
2-18 小时包被抗体
30 分钟制备人PBMCs
20 分钟分析设置
2-4 天孵育
实验步骤
抗体包被至微孔板：
1、 用无菌 PBS 制备 10µg/ml 的 anti-CD3e抗体溶液，计算所需的抗体量，每个条件或样品做复孔。例如，包被半张板需要 2.6ml 抗体溶液(48孔板)。若用其他抗体共刺激时，CD3 抗体的浓度可以降低。
2、 96孔板中，每孔加入 50μl 抗体，空白对照孔加 50μl 无菌 PBS。
3、 用 ParafilmTM 膜将板封好，37℃孵育 2 小时或 4℃过夜。
4、 加细胞之前，将孔内的抗体溶液吸去。
5、 每孔用 200μl 无菌 PBS 洗后，弃去 PBS。
6、 重复洗一次，去除所有的未结合抗体。
加细胞：
1、 计数细胞并重悬于RPMI-1640 完全培养基中，浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml～105/ml的浓度。
2、 洗板结束后，每孔加 100μl 细胞悬液，每个样本重复做3个孔。
3、 加入anti-CD28抗体使工作浓度为2ug/ml。
4、 37°C, CO2 培养箱孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。
5、 收获细胞，继续其他方面的实验检测。
活化效果流式验证方案
人PBMC细胞T细胞体外活化流式法验证
