啥都能用多聚甲醛固定吗?

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作者:联科生物 发布日期:2017-07-19 09:00

多聚甲醛,胞内染色,细胞固定,抗体染色.裂解全血
我们实验中,标本中大多数神经激素、肽类物质,以及蛋白质为水溶性,在用于研究之前,常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能与蛋白质的氨基反应,使蛋白质凝固,因此在医药上可做检验时的组织固定剂、以及防腐剂等。而在固定剂中,最常用的是多聚甲醛。
多聚甲醛染色前固定
做实验的过程中,因为排不上实验仪器、希望标本能够较长时间存放等等原因,很多实验人员习惯性都会用4%多聚甲醛预先固定标本。也有为了灭活标本里面可能存在的微生物(细菌、病毒等),起到安全保障作用;或者是做胞内染色前的准备,进行固定细胞 。

然而,可能很多人忽视了一点,就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本,细胞表面有些位点在固定后构象发生改变,使得抗体无法结合产生假阴性,也可能由于固定作用,导致其它位点产生非特异性结合(假阳性)。

因此,知道哪些抗体染色前不能预固定,十分重要。贴心的技术人员帮我们做了一系列测试,下面两张表,可以看的出来,大多数不能固定的抗体都是趋化因子受体类目的,这类抗体,大家在实验中要注意不能先固定后染色。
—— 人源样本——

实验样本 克隆号 标记物 是否适合固定
裂解全血, 淋巴细胞 L263G8 CCR8 No
裂解全血, 淋巴细胞 1712380 CCR10 No
裂解全血, 淋巴细胞 UCHT1 CD3 Yes
裂解全血 OKT3 CD3 Yes
裂解全血 HIT3a CD3 Yes
裂解全血 SK7 CD3 Yes
裂解全血 OKT4 CD4 Yes
裂解全血 RPA-T4 CD4 Yes
裂解全血 UCHT2 CD5 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 BL-CD6 CD6 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 CD7-6B7 CD7 Yes
裂解全血 RPA-T8 CD8 Yes
裂解全血 HIT8a CD8 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 HI111 CD11a Yes
裂解全血 ICRF44 CD11b Yes
裂解全血, 单核细胞 3.9 CD11c No
裂解全血 WM15 CD13 Yes
裂解全血, 单核细胞 M5E2 CD14 Yes
裂解全血 HCD14 CD14 Yes
裂解全血 W6D3 CD15 Yes
裂解全血, 粒细胞 HI98 CD15 Yes
裂解全血 3G8 CD16 Yes
裂解全血 TS1/18 CD18 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 HIB19 CD19 Yes
裂解全血 EBVCS-5 CD23 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 ML5 CD24 No
裂解全血 BC96 CD25 No
裂解全血 O323 CD27 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 M-T271 CD27 Yes
裂解全血 CD28.2 CD28 Yes
裂解全血 WM59 CD31 Yes
裂解全血 581 CD34 No
裂解全血 HIT2 CD38 Yes
裂解全血 5C3 CD40 Yes
裂解全血 HI30 CD45 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 CC2C6 CD47 Yes
裂解全血 CBR-IC3/1 CD50 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 MEM-188 CD56 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 HCD56 CD56 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 DREG-56 CD62L Yes
裂解全血, 单核细胞 IT2.2 CD86 Yes
裂解全血, 粒细胞 S5/1 CD88 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 DX2 CD95 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 HCD99 CD99 Yes
裂解全血, 淋巴细胞 A019D5 CD127 (IL-7Rα) No
裂解全血 Ber-ACT35 CD134 No
裂解全血 SE5A5 CD172a/b Yes
裂解全血 LSB2.20 CD172g Yes
裂解全血, 粒细胞. 淋巴细胞 8F1/CXCR1 CD181 (CXCR1) No
裂解全血, 粒细胞 5E8/CXCR2 CD182 (CXCR2) No
裂解全血, 淋巴细胞 G025H7 CD183 (CXCR3) No
裂解全血, 淋巴细胞 12G5 CD184 (CXCR4) Yes
裂解全血, 粒细胞 500000000 CD193 (CCR3) No
裂解全血, 淋巴细胞 L291H4 CD194 (CCR4) No
裂解全血, 淋巴细胞 T21/8 CD195 (CCR5) No
裂解全血, 淋巴细胞 HEK/1/85a CD195 (CCR5) No
裂解全血, 淋巴细胞 J418F1 CD195 (CCR5) No
裂解全血, 淋巴细胞 G034E3 CD196 (CCR6) No
裂解全血, 淋巴细胞 G043H7 CD197 (CCR7) No
裂解全血, 淋巴细胞 L053E8 CD199 (CCR9) No
裂解全血 C1.7 CD244 (2B4) Yes
裂解全血 11C1 CD268 (BAFF-R) Yes
裂解全血, 淋巴细胞 EH12.2H7 CD279 No
裂解全血 TL2.1 CD282 (TLR2) Yes
裂解全血, 淋巴细胞 2A9-1 CX3CR1 No
裂解全血, 淋巴细胞 K0124E1 CX3CR1 No
裂解全血 L243 HLA-DR Yes
裂解全血 MHM-88 IgM No

—— 小鼠样本 ——

实验样本 克隆号 标记物 是否适合固定
C57BL/6 小鼠脾脏 1B1 CD1d No
C57BL/6 小鼠脾脏 17A2 CD3 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 145-2C11 CD3 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 RM4-5 CD4 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 GK1.5 CD4 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 RM4-4 CD4 No
C57BL/6 小鼠脾脏 53-7.3 CD5 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 53-6.7 CD8a Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 YTS156.7.7 CD8b Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 53-5.8 CD8b.2 No
C57BL/6 小鼠骨髓 M1/70 CD11b Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 N418 CD11c No
C57BL/6 小鼠脾脏 93 CD16/32 No
C57BL/6 小鼠脾脏 6D5 CD19 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 7000000000 CD21/35 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 B3B4 CD23 No
C57BL/6 小鼠脾脏 M1/69 CD24 No
C57BL/6 小鼠脾脏 LG.3A10 CD27 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 37.51 CD28 No
C57BL/6 小鼠脾脏 HMβ1-1 CD29 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 MEC13.3 CD31 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 390 CD31 No
C57BL/6 小鼠脾脏 HM40-3 CD40 No
C57BL/6 小鼠脾脏 42817 CD40 No
C57BL/6 小鼠脾脏 IM7 CD44 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 30-F11 CD45 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 104 CD45.2 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 RA3-6B2 CD45R (B220) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 HM48-1 CD48 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 HMα2 CD49b No
C57BL/6 小鼠脾脏 MEL-14 CD62L No
C57BL/6 小鼠骨髓 RI7217 CD71 No
C57BL/6 小鼠脾脏 EAT-2 CD81 No
C57BL/6 小鼠骨髓 20/70 CD88 (C5aR) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 20000000 CD103 No
C57BL/6 小鼠骨髓 2B8 CD117 (c-kit) No
C57BL/6 小鼠脾脏 TM-β1 CD122 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 A7R34 CD127 (IL-7Rα) No
C57BL/6 小鼠骨髓 A2F10 CD135 No
C57BL/6 小鼠脾脏 281-2 CD138 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 12F12.2 CD150 No
C57BL/6 小鼠脾脏 CXCR3-173 CD183 (CXCR3) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 29-2L17 CD196 (CCR6) No
C57BL/6 小鼠脾脏 4B12 CD197 (CCR7) No
C57BL/6 小鼠骨髓 NLDC-145 CD205 (DEC-205) No
C57BL/6 小鼠脾脏 1B1.3a CD210 (IL-10R) No
C57BL/6 小鼠脾脏 10F.9G2 CD274 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 927 CD317 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 29A1.4 CD335 Yes
C57BL/6 小鼠骨髓 RB6-8C5 Gr1 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 AF6-88.5 H-2kb Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 M5/114.15.2 I-A/I-E Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 AF6-120.1 I-Ab No
C57BL/6 小鼠脾脏 11-26c.2a IgD Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 RMM-1 IgM Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 2F1/KLRG1 KLRG1 (MAFA) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 DATK32 LPAM-1 No
C57BL/6 小鼠骨髓 HK1.4 Ly6C Yes
C57BL/6 小鼠骨髓 1A8 Ly6G Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 PK136 NK1.1 Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 E13-161.7 Sca-1 (Ly6A/E) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 D7 Sca-1 (Ly6A/E) Yes
C57BL/6 小鼠脾脏 551 Siglec H No
C57BL/6 小鼠脾脏 H57-597 TCRβ Yes
C57BL/6 小鼠骨髓 TER-119 TER-119 Yes

多聚甲醛染色后固定
染色后的固定,就与抗原构象关系不大了,更多的是荧光素。以前4色以内的时候,用的荧光素都是非串联的,因此大多数影响不大,但随着各种新型串联染料的出现,多聚甲醛固定就成了问题了。

事实上,当你去搜索串联染色标记(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗体时,会发现一些比较详细的描述里面会注明,用多聚甲醛固定过的样本,必须在4小时内检测,否则容易导致串联染料降解,若要长时间保存,还是需要洗涤后,转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。

需要注意的是,做GFP荧光检测的同学,也需要注意一下,多聚甲醛固定也会影响GFP,多聚甲醛固定后,并非使GFP荧光淬灭,而是使GFP蛋白构象发生改变,无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光,或剩余的未被改变构象的GFP发出的。
解决方案
1、 如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子,请尽量不要预固定,如需长期保存样本,可以考虑冻存单个核细胞2、 如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子,可用1%多聚甲醛固定保存,但FSC、SSC和荧光强度影响较大。3、 如果希望在染色后保持较长时间荧光稳定,仍首选建议:避光、4度,如果仍不放心,可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用固定剂。