细胞因子是一种小分子蛋白质，包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等，在免疫和炎症反应中起重要作用。趋化因子是能使细胞发生趋化运动的一类细胞因子，其结构相似，绝大多数趋化因子含有4个保守的半胱氨酸， 根据前两个半胱氨酸的相对位置不同，趋化因子可分为CXC（α）、CC（β）、C（δ）和CX3C（γ）4个亚家族，C代表半胱氨酸，X代表任意氨基酸。趋化因子受体属于7次跨膜的G蛋白偶联受体超家族，分为CXC受体、 CC受体、 C受体和CX3C受体。趋化因子及其受体在炎症、肿瘤、自身免疫病、变态反应、AIDS等过程中发挥重要作用，已有多种趋化因子相关产品进入临床研究，有望为肿瘤和某些炎性疾病的治疗提供新的思路和和方法。目前，趋化因子研究已渗透到生命科学的各个领域，发现新的趋化因子并对其进行深入研究将具有重要的理论意义和应用价值。
1.趋化素样因子1（chemokine like factor-1，CKLF-1）的产生
随着现代分子生物学技术尤其是生物信息学技术的迅速发展，大量新的趋化因子得以发现。目前国际上克隆到的人类趋化因子约有50种，趋化因子受体已近20种。为了克隆新细胞因子，科研人员利用IL-10是一种广谱的细胞因子合成抑制剂的原理，推测被IL-10所抑制的分子很可能还有其它未被发现的新细胞因子，因而建立了一条新的技术路线：利用抑制性减数杂交技术（SSH），以PHA刺激的U937细胞为tester，以PHA刺激同时IL-10抑制的U937细胞为driver进行减数杂交，研究IL-10抑制的U937细胞表达基因，进行EST比较和拼接，得到的差异表达基因中可能有新的细胞因子候选基因。通过这一技术，我们首次成功克隆了一个新细胞因子，命名为趋化素样因子1（chemokine like factor-1，CKLF-1），并发现其至少存在其它3种不同的变异体，分别命名为CKLF-2，3，4。
2.CKLF1的简介
CKLF1全长cDNA包括530个碱基，有一个编码99个氨基酸的完整开放读码框架。Northern blot分析发现， CKLF1约为0.6kb，其在PHA刺激的U937细胞中的表达可被IL-10部分抑制。CKLF-2，3，4分别编码152、67、和120个氨基酸，它们与CKLF1有相同的氨基端和羧基端。人类基因组数据库检索发现，CKLF基因位于16号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，内含子和外显子交界处序列符合真核细胞剪接规律。CKLF1，2，3，4有共同的外显子1和4，选择性拥有外显子2和3，这进一步证明它们为同一基因的不同剪接形式。CKLF1-4的表达谱较广，其中CKLF1，2的表达水平较高，而CKLF3的表达水平最低。
3.CKLFs的生物学活性研究
为了研究CKLFs的生物学活性，研究人员构建了真核表达载体pcDI-CKLF1和 pcDI-CKLF2，转染COS-7细胞，用微孔穿膜法对转染细胞上清进行趋化活性分析，发现CKLF1对人中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞有明显的趋化活性。同时，将pcDI-CKLF1裸质粒注射到BALB/c小鼠肌肉中， 研究其体内活性。注射质粒10天后，取注射部位肌肉组织，切片，染色。与空载体对照组相比，pcDI-CKLF1组小鼠肌肉切片中有明显的细胞浸润增多现象。特殊染色和形态学观察发现CKLF1在体内能够趋化嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，与体外趋化结果一致。CKLF1除了引起注射局部细胞浸润增多外，还引起骨骼肌细胞核居中排列等肌肉组织再生现象。此外，pcDI-CKLF1注射小鼠肺部炎性病变明显，支气管变形，管腔内有脱落的上皮和渗出物，肺组织充血水肿，炎细胞浸润，与哮喘发病后期的病理改变非常相似。目前，尚没有发现其它单一因子能引起如此明显的病理改变，这提示CKLF-1在呼吸系统炎症性疾病的发病过程中可能起重要作用。将来利用CKLF-1的拮抗剂，有可能起到治疗作用。CKLF-1除了具有广谱的趋化活性外，还能够促进骨骼肌原代肌卫星细胞和造血干/祖细胞的增殖，促进人骨髓细胞集落形成。CKLF-2 是CKLF-1的全基因产物，其趋化作用很弱，但骨骼肌刺激活性较强。为研究其对骨骼肌细胞的作用，我们建立了稳定表达CKLF-2的小鼠肌母细胞系C2C12，发现其增殖明显加速，倍增时间缩短；CKLF-2除了具有促C2C12细胞增殖活性外，还能促进C2C12细胞分化，在高血清培养条件下，CKLF-2/C2C12细胞融合加速，肌管增多；同时，肌细胞分化的特异性分子肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)和生肌素(myogenin)的表达水平明显增加。CKLF-2的这种既能促进骨骼肌细胞增殖，又能促进其分化的作用，与胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor I, IGF-1）的作用类似。另外，CKLF-2还能促进3T3细胞增殖；拮抗撤血清引起的3T3细胞凋亡。
总结
综上所述，我们成功克隆了一个新的有重要功能的基因家族趋化素样因子超家族，其中，CKLF有四种变异体，CKLF1，3是分泌性蛋白质，CKLF2，4为膜蛋白。CKLF1具有连续两个半胱氨酸的特征性结构，定位于16号染色体，与TARC和STCP-1有低水平的同源性。在目前发现的所有CC家族趋化因子中，只有TARC和STCP-1定位于16号染色体上；重组CKLF1在体内外具有广谱的趋化活性，CKLF1能够与CCR4反应，而CCR4同时也是TARC和STCP-1的受体；FRN是目前发现的唯一一种CX3C趋化因子，也是膜结合型趋化因子，其基因与TARC和STCP-1在16号染色体上紧密连锁，而大鼠和小鼠CKLFs的特征性结构为CX3C。这提示CKLF与TARC、STCP-1和FRN在进化上具有一定的相关性。CKLF2能够促进细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡，提示CKLF在机体的生理和病理作用中具有重要意义，CKLF-RP1-4的成功克隆表明CKLF可能代表一个新的基因超家族，对这个家族基因进行深入研究将具有重要的理论意义和潜在的应用价值。此外，我们建立的克隆新细胞因子的技术路线可能对其它因子的发现具有借鉴意义。
参考文献：
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