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流式细胞术之免疫表型分析如何染色

作者:联科生物    发布日期:2020-06-23 08:30


流式细胞术是当代最先进的细胞定量分析技术,可对多个检测目标进行多参数特性分析,具有特异性强、灵敏度高、速度快等特点。目前,流式细胞术在临床上常用于各类白血病、淋巴瘤的分型诊断及干细胞移植效果评估等领域。



细胞免疫表型分析是流式细胞术的一种重要应用,免疫表型分析实验常包括单细胞悬液制备、细胞表面抗体染色、胞内抗体染色和核内抗体染色等步骤。本期我们就来讲讲关于流式实验抗体染色的具体操作步骤。

 

一、表 面 抗 体 染 色

¤ 细胞样本:

1. 取100 μl细胞悬液(细胞计数后用流式染色缓冲液Flow Cytometry Staining Buffer调整浓度为1×107/ml);

2. 加入适量表面抗体,室温避光孵育15 min(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书);

3. 加入1~2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清;

4. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。

¤ 全血样本:

1. 取一定体积抗凝全血(人100 μl,小鼠取30~50 μl);

2. 加入适量表面抗体,室温避光孵育15 min(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书);

3. 按溶血素(红细胞裂解液)使用说明裂解红细胞;

4.加入1~2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清;

5. 用 500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。

注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。

 

二 、胞 内 抗 体 染 色

1.制备好细胞悬液,取100 μl(全血样本:人100 μl,小鼠30~50 μl)染表面抗体,室温避光孵育15 min,不用洗涤;

2. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM A固定剂,室温孵育15 min;

3. 加入3 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清,涡旋振荡,使残留液体混匀沉淀;

4. 加入100 μl FIX&PERM MEDIUM B破膜剂和胞内抗体(和/或相应的同型对照),室温避光孵育15 min;

5. 加入3 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃上清收集细胞;

6. 用500 μl 流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。

注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。

 

三、核 内 抗 体 染 色

使用FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit,也适用于胞浆和核内蛋白的同时检测

1. 取100 μl样本,根据实验方案和产品说明书,加入适量抗体进行表面染色;全血样本孵育抗体后加入不含固定剂的溶血素(按厂家说明操作),溶血完毕;

2. 加入2 ml流式染色缓冲液,300 g离心5 min,弃去上清;

3. 配置1×固定/破膜工作液,注意要新鲜配制;

4. 每管加入1 ml固定/破膜工作液,涡旋振荡混匀,室温避光孵育30-60 min;

5. 用蒸馏水稀释配置1×破膜缓冲液;在流式管中染色,每个样本需要 8.5 ml;

6. 无需洗涤,每管加入2 ml 1×破膜缓冲液,300 g 离心5 min,弃去上清;

7. 重复步骤6(可选);

8. 用100 μl 1×破膜缓冲液重悬细胞;

9. 加入2 μl胞内抗体来源的血清阻断,室温避光孵育15 min;

10. 无需洗涤,体系加入适量的FoxP3抗体或其他核内及胞浆抗体或等量的同型对照(抗体用量和孵育条件详见抗体说明书),振荡混匀,室温避光孵育至少30 min;

11. 每管加入2 ml 1×破膜缓冲液,300 g离心5 min,弃去上清;

12. 重复步骤11(可选);

13. 用500 μl流式染色缓冲液重悬细胞,上机检测并分析。

注意:如不能立即检测,用0.5 ml 0.1%~4%多聚甲醛重悬,4℃避光保存,24 h内上机分析。

 

四、相 关 产 品

 
目录号 产品名称 规格
  70-S1001   Flow Cytometry Staining buffer流式染色缓冲液   125 ml
  70-LYS   FCM Lysing solution(Fixative Free) 10X红细胞裂解液(不含固定剂)   100/250/500 T
  70-LSC   FCM Lysing solution for BC即用型红细胞裂解液(适用于贝克曼机器)   100/250 T
  70-LSB   Lysing solution for FACS 10X红细胞裂解液(适用于BD机器)   100/250/500 T
  83013   溶血素   100/250/500 T
  70-GAS   FIX&PERM Kit固定破膜剂   50/100/200/500/ 1000 T
  70-GAS001   FIX & PERM MEDIUM A固定剂   50 T
  70-GAS006-1   FIX & PERM MEDIUM B破膜剂   200 T
  70-IC001   FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit核内染色试剂盒   20/100 T
  70-F0001   多聚甲醛溶液,4%   100 ml
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