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全血 Foxp3 实验操作步骤

作者:联科生物    发布日期:2018-12-10 09:00

 


1. 取 100ul 全血,按照细胞表面抗原染色方法标记 CD4 和 CD25。根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量。按个人要求设置空白管、对照管、补偿管和样本管。4 ℃孵育 30分钟。


2. 用去离子水(不能用 PBS)将溶血素稀释成 1×。每管用量为 2ml。


3. 染色完的全血不用洗,加 2ml 稀释好的溶血素,迅速混匀,静置 8~10 分钟,观察溶液透亮后用预冷 PBS 溶液洗涤细胞,300 -400 g 离心 5 分钟,去上清。


4. 用 3 倍体积的固定/破膜稀释液(#ICD01) 稀释 固定/破膜浓缩液(#ICC01),制成固定/破膜工作液,注意要新鲜配制,每管的用量为 1ml。


5. 旋涡震荡重悬细胞后加入 1ml 的固定/破膜工作液(Fixation/Permeabilization)(1:3 稀释好),并再次旋涡混匀。


6. 避光 4℃孵育 30 分钟到 60 分钟。


7. 将破膜缓冲液(#ICB01)用去离子水 1:9 稀释,制成工作液。每管的用量为 8.5ml。


8. 无需洗涤,直接加入 2ml 破膜缓冲液工作液(Permeabilization Buffer)300 -400 g 离心洗涤细胞并弃去上清液。


9.(可选)重复第 9 步操作洗涤细胞。


10. 加入 100 ul PBS 重悬细胞。


11. 加入大鼠血清 2 ul,室温避光孵育 30 分钟。


12. 加入适量的 Foxp3 抗体,对照管中加入适量的同型对照,具体用量参照说明书,避光 4℃孵育至少 30 分钟。


13. 加入 2ml 破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。


14. 重复上一步洗涤细胞。


15. 用适量体积的 Flow Cytometry Staining Buffer 重悬细胞,并上机检测并分析。注:由于染色过程中使用了细胞固定和破膜,对比起活细胞在形态上会有一定变化,因此FSC/SSC 图中圈门时需要做一定调整。


注:以上说明书仅供参考,具体实验请对照厂商说明书操作。

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