ELISA系列 | ELISA检测TGF-β,样本该怎样活化?

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TGF-β超家族简介

转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)是一类多效性细胞因子,在细胞增殖、分化、免疫调节及维持机体稳态等方面具有重要的作用。TGF-β包括三种不同的亚型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β信号通路的异常与多种疾病的发生发展密切相关,如癌症、纤维化和神经退行性疾病等。TGF-β1基因结构具有高度保守性,人和小鼠TGF-β1的同源性高达99%。

TGF-β的分泌与活化

TGF-β最初以一种非活性的前体形式(latent TGF-β,L-TGF-β)被合成和分泌。

(A)TGF-β家族蛋白被合成为前体分子,由信号肽、前结构域和成熟多肽组成。去除信号肽后,通过碱性残基的蛋白水解裂解进一步加工前体,从而将前结构域与成熟多肽分离,后者保持非共价结合。

(B)潜伏的TGF-β 复合物可以通过与潜伏的TGF-β结合蛋白(LTBP)的二硫键结合成一个大的潜伏复合物 (LLC),使潜在的TGF-β稳定储存而不是进一步激活。此外,潜伏的TGF-β还可与Treg或巨噬细胞表面的跨膜糖蛋白A为主的重复序列蛋白(GARP)和LRRC33结合。在LAP上的Arg-Gly-Asp(RGD)序列与整合素αvβ6或αvβ8相互作用后, TGF-β1和TGF-β2才从其潜伏复合物中变构释放。

(C)长细胞体从细胞体延伸,并将TGF-β家族受体呈递给配体复合物。配体与受体的结合导致II型受体(浅灰色)激活I型受体(中至深灰色)。

所以,TGF-β只有从潜伏复合物中释放出来,TGF-β才能具有活性,并激活其受体。

图1 TGF-β配体处理和呈递

联科样本活化小妙招

机体多种细胞均可分泌非活性状态的TGF-β。在体外,非活性状态的TGF-β又称为latency associated peptide (LAP),通过酸处理可被活化。

对于这个特殊的指标,联科生物经反复验证,提供以下步骤供参考(标准品已经是活化好的,无需活化):
如Human TGF-β1 血清、血浆样本活化步骤:
01 加样:涡旋振荡混匀样本,血清、血浆取40 uL样本加入1.5 mL EP管中。细胞上清样本/尿液样本所需样本体积,具体请参考说明书。
02 加酸活化:加20 μL 1N HCl 混合均匀,室温孵育酸化10分钟。
03 加碱中和:加20 μL 1N NaOH 终止酸化。
04 样本活化结束。由于血清中TGF-β1含量较高,活化后血清样本需经20倍预稀释。细胞培养上清/尿液必须在活化后立即检测分析。

另请注意:细胞培养基中的动物血清可能含有高浓度的潜隐TGF-β1。为了获得最好的实验结果,在TGF-β1测定试验中使用不含动物血清的细胞培养基。如果使用了含有动物血清的细胞培养基,应该设立适当的对照,确定TGF-β1 的基准浓度。

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参考文献:

[1]Jia S, Meng A. TGFβ family signaling and development. Development. 2021 Mar 12;148(5):dev188490. doi: 10.1242/dev.188490. PMID: 33712443.