流式非特异性荧光的照妖镜-同型对照

什么是同型对照

同型对照是指与检测抗体相同种属来源、相同亚型、相同荧光标记,但对目标靶点没有特异性结合的抗体。它能让非特异性荧光现原形,从而得到真正的阳性目的细胞群。

同型对照的作用

衡量抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色情况。

为何需要同型对照

我们都知道抗体是由Fab和Fc构成的(Y字型),其中Fab端是可变区域,能与抗原特异性结合,而Fc端是恒定的,它可以和我们表达Fc受体的细胞非特异结合,免疫细胞(除了T细胞)表面大多表达Fc受体,其中以单核细胞、巨噬细胞尤甚,这就意味着我们检测出来的阳性不仅包括目标细胞,还包括了表达Fc受体的非目的细胞,为了识别检测结果中的非目的细胞群,我们可以使用同型对照。

如何选择合适的同型对照?

1.基本原则

同型对照一般选择与一抗完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体。例如一抗是抗人的CD4-FITC抗体,来源种属是Mouse ,亚型和亚链是IgG2a, κ, 那么它的同型对照应该是FITC标记的Mouse IgG2a,κ。一抗的种属来源、亚型和亚链、荧光标记信息可在产品说明书中找到,如截图中的产品

2.特殊原则

如果是抗体的组合形式是纯化的一抗+荧光标记的二抗,那么应该选择一抗的同型对照。

3.次要原则

如果找不到完全相同的同型对照,在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下,再按照亚链不同--亚型不同--相同类别的顺序选择。

例如抗体的成分是FITC标记的Mouse IgG2a, κ, 那么

优先选择FITC标记的Mouse IgG2а为同型对照,

次要选择是FITC标记的Mouse IgG2b,

最后选择的才是FITC标记的Mouse IgG2。

同型对照应用场景

1.可不用同型对照的场景

流式图分群清晰明显可不使用同型对照,如CD3、CD4、CD8等指标,此时可根据阴性细胞的显著分群进行设门

2.可考虑使用同型对照的情况

- 做胞内流式实验,比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等

- 检测表面标志特异性不高或者不常见的指标,如多抗,非特异性结合非常多,使用同型对照可排除假阳性

- 不熟悉不常见标志的表达情况,根据同型对照可以判断阳性细胞的位置

- 如果样本中存在死细胞,由于死细胞的非特异性染色较强,故需要使用同型对照与死活染料共同来判断假阳性细胞

小鼠脾脏样本Treg实验同型对照结果

小鼠脾脏样本Treg实验样本结果

同型对照实验Q&A

1. 同型对照比阴性细胞荧光强,会是什么原因呢?
建议从以下几个方面进行排查
- 检查同型对照选择是否选择正确
- 需要对目标抗体进行滴定,因为浓度饱和会造成阴性峰的偏移和基底增宽。确保同型对照使用浓度和滴定后的一抗保持一致
- 同型对照一定要用细胞,而且和实验样本保持一致
- 因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高,而跟其类似的抗原非常多,那么加入同型对照时,同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性,所以会造成这种现象,这时候可添加商品化的Fc阻断剂来进一步阻断。如联科的Anti-Mouse CD16/CD32, Purified (Clone:2.4G2)功能抗体(货号:F210163200),在流式检测中,可对细胞表面的Fc受体进行封闭,减少非特异性结合。

2.如果实验中同时染多个抗体会用到了多种荧光素,在进行分析时,荧光渗漏对结果的影响较为明显,同型对照无法反映出其它通道渗漏的荧光背景,该怎么办?

建议通过联合使用同型对照与FMO对照,来消除荧光溢漏和非特异性结合造成的影响。

3.同型对照的用量怎么确定?

一般需要与染色的单克隆抗体相同剂量和浓度,或者咨询试剂厂家推荐的用量。

希望通过本文的介绍大家对同型对照有个初步的了解,如何有其他想要了解的地方,欢迎在评论区给小科留言。

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