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分享|流式细胞术检测信号及意义

作者:小科    发布日期:2021-03-16 14:00



流 式 细 胞 术:

是当代最先进的细胞定量分析技术之一,它是在流动的状态下,快速地检测细胞或颗粒的特异性指标,实现对多个检测目标多参数特性分析。具有特异性强,灵敏度高,速度快,可分析、可分选的特点。流式细胞术检测信号分为散射光信号和荧光信号两种。

 

散 射 光 信 号


散射光信号分为前向散射光和侧向散射光,前者也叫小角度散射光,后者也叫90°角散射光。


前向散射光(forward scatter, FSC)是正向收集的散射光信号。一般来说,FSC可以反映细胞的大小,FSC强则细胞大一些,反之则细胞小一些。但当检测目标为非球形细胞(如红细胞、精子等),由于细胞在液流系统中的朝向不一致,通过激光检测时容易出现同型细胞FSC差别很大,这个需要特别注意。


侧向散射光(side scatter, SSC)是侧向收集的散射光信号。SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,其强度与细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。通常,一个细胞内部细胞器和颗粒越多,其SSC就越强。



利用FSC/SSC双参数测定,可以从一些未添加荧光染料的样本中鉴别出若干个细胞亚群。最为经典的就是利用FSC/SSC双参数将人外周血白细胞分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个亚群(如下图),淋巴细胞FSC和SSC均较小,单核细胞FSC较大、SSC中等,粒细胞FSC和SSC均较大。




荧 光 信 号
 

荧光信号也分为两种。一种是细胞自身就有的荧光在激光照射下发出的荧光信号,称为细胞自发荧光;另一种是人为用特异性荧光素标记细胞,如用荧光素标记的单克隆抗体特异性地结合胞膜、胞质、核膜的相应抗原,这些荧光素通过激光激发产生的信号。荧光信号的强弱反映了细胞抗原的表达含量,通过荧光信号我们可以对细胞亚群和功能进行分析。
 


荧光素的选择一般遵循几个原则:① 仪器需满足激光管可激发相应的荧光素且可同时检测所需的荧光;② 染料的亮度与抗原表达量相匹配,低表达抗原,推荐使用亮荧光染料,高表达抗原,推荐使用弱荧光染料;③ 尽量选择光谱重叠小的荧光素,光谱重叠严重的荧光素同时检测会导致荧光溢漏,需调节补偿;④ 尽量使用红色激光激发自发荧光高的样本。


流式细胞术的应用颇为广泛,利用两种检测信号可实现对细胞大小、颗粒度及内部结构(如细胞器)、细胞状态(凋亡/周期)、细胞内离子(Ca2+、pH、ROS)、细胞表型等的检测分析。

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