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干货分享|流式细胞术常见样本的制备与保存

作者:小科    发布日期:2021-03-15 09:00



流式细胞术(flow cytometry, FCM)是当代最先进的细胞分析技术之一,包括各种细胞的计数、细胞中抗原分子的检测、细胞中DNA和RNA的倍体分析、细胞的生物学特性及功能分析等。在血液学检测中,应用FCM分析的样本多为外周血、骨髓、各类体液(如脑脊液、胸水、腹水)以及人体的组织(如淋巴结、脾、肝等),下面我们将介绍这几种常见样本的制备方法,样本制备的好坏对最终的检测结果有很大影响。

 

外 周 血 或 骨 髓

1. 保存方法

收集样本后置于加有抗凝剂(一般选择肝素或EDTA)的试管中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,此时最好选择肝素抗凝管。


2. 处理方法

一般不需要特殊处理制备单细胞悬液,所用试剂为淋巴细胞分离液和红细胞裂解液。但在临床检测中,为了避免细胞成分丢失,通常不推荐使用淋巴细胞分离液分离单核细胞。


3. 抗凝剂的选择

血液标本可以使用EDTA、ACD(枸橼酸葡萄糖)或肝素抗凝。

一般认为,ACD和肝素抗凝的样本72 h内细胞是稳定的;EDTA抗凝48 h内是稳定的,但超过24 h则认为不是很好了。

EDTA适用于白细胞的免疫表型分析,可防止成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失,并具有较强的抗血小板凝集能力,但对细胞活性的保持不如肝素抗凝。同时EDTA是二价阳离子的强螯合剂,会影响与Ca2+相关的抗原位点(如CD11b等),并会抑制与Ca2+相关的细胞功能。肝素常用于白细胞功能研究,可维持Ca2+和Mg2+在细胞内的生理浓度,更好保持细胞活性,适用于放置时间较长、不能及时检测的样本,但不适合血小板的相关检测。

骨髓样本优先选择肝素抗凝。
 

体  液

1. 保存方法

收集样本后置于肝素抗凝管中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,保存时间最好不要超过48 h。

2. 处理方法

a. 样本1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

b. 加入含有0.1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS),离心洗涤5 min;
c. 加入适量PBS重悬。如有细小沉淀,用300目尼龙网过滤后备用。


组  织

1. 保存方法

切取新鲜组织样本置于生理盐水或PBS中,室温保存,尽量在12 h内处理样本;若无法及时处理,4℃保存,保存时间最好不要超过48 h。不建议用甲醛、乙醇固定细胞,不要用酶、表面活性剂处理细胞。


2. 处理方法

常用的组织样本制备单细胞悬液方法有:机械法、酶处理法、化学试剂处理法及表面活性剂处理法,在流式分析中,为保持抗原活性,多采用机械法处理样本。采用机械法需注意动作轻柔,尽量减少细胞的损伤。

若实验室无单细胞制备仪,手工剪切制备单细胞悬液:

a. PBS清洗组织样本,去除大量红细胞;

b. 用眼科剪将组织剪成极小块,再次PBS清洗;

c. 组织小块加入匀浆器中,加少量PBS匀浆;

d. 用细注射针头抽取细胞悬液;

e. 300目尼龙网过滤;

f. 加入含0.1%牛血清白蛋白的PBS;

g. 1000-1500 rpm离心5 min,弃去上清;

h. 加入适量PBS重悬。

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