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给细菌穿个“迷彩服”

作者:池博专刊    发布日期:2020-07-24 13:00


细菌由于具有基因易于改造,可以被抗生素控制,能够在哺乳动物宿主的特定身体部位(例如肠道或皮肤)以及疾病部位(包括脓肿和肿瘤组织)定植等优点,被广泛用作益生菌口服以防止病原体定植,或作为介导进行肿瘤治疗。最近,多种细菌疗法已在人类身上实施,并进入第一期临床试验。然而,目前细菌体内应用仍存障碍,主要是机体对细菌的快速清除和免疫原性引起的副作用。本文是上海交通大学分子医学研究院刘尽尧课题组利用细胞膜伪装细菌以应对这种障碍的探索。


1、细胞膜包被细菌(CMCB)的制备及特性分析

从6-8周大的雄性小鼠的红细胞中提取红细胞膜。所得膜与大肠杆菌EcN混合,然后挤出多孔聚碳酸酯膜(孔径:1μm),成功制备了CMCB。椭圆形粪肠球菌(E.faecalis)和球形金黄色葡萄球菌(S.aureus)等不同形状的细菌也可以被包衣,显示了这种方法对伪装不同菌株的广泛适用性(图1b和补充图3)。FITC标记抗CD47抗体与CMCB孵育,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)进一步观察CMCB,显示大肠杆菌EcN表达的mCherry(红色)被细胞膜(绿色)覆盖。流式细胞仪分析CMCB的平均荧光强度约为未包膜细菌的10倍,证明包膜成功(图1d)。另外,western-blotting显示CMCB中存在CD47蛋白,表明细菌表面存在覆盖膜。与未包膜细菌相比,包被红细胞膜对细菌生长和活力没有影响(图1e,1f)。


2、包膜细菌在体内血液循环中的存留时间

细菌包膜后显著提高了在小鼠血液中的留存时间(图2a),减轻了细菌被腹腔巨噬细胞的吞噬(图2b,c,d)。


3、体内炎症反应

与注射不包膜细菌小鼠相比,注射CMCB的小鼠白细胞,红细胞,血小板的计数高(图3a-c),炎性相关因子含量低(图3d-f)。说明CMCB引起的急性炎症反应要较不包膜细菌轻。


 

4、CMCB在荷瘤小鼠体内的分布

荷瘤小鼠注射未包膜细菌和包膜细菌CMCB后1小时,大部分细菌积聚在肝脏和脾脏。不过在CMCB处理中,肿瘤组织中细菌集聚水平高于注射不包膜细菌的处理(图4a,b)。随着时间的延长,健康组织中的细菌数量持续显著下降,而肿瘤组织中的细菌数量增加。给药后12天,注射CMCB的小鼠肿瘤内的细菌数量是健康组织的3240倍,是未包膜细菌处理的42倍(图4g)。这些数据证明了包被细菌的优越的肿瘤定植能力。


5、体内肿瘤显像

小鼠注射luxCDABE工程化细菌EcN后可见发光信号。与传统的小分子染料和纳米探针不同,EcN主要出现在肿瘤部位。注射3天后,CMCB处理的小鼠,其肿瘤的平均发光信号比注射未包膜细菌处理的小鼠高5倍,且几乎所有检测到的信号都聚集于肿瘤部位(图5)。除了良好的肿瘤聚集性外,这些细菌能够在肿瘤组织内繁殖,并在数天内保持其发光信号的一致性。注射第12天后,注射CMCB的小鼠肿瘤的信号强度仍然是未包膜细菌的56倍。这些结果表明CMCB有可能成为一种有效的肿瘤成像工具。


6、包膜的去除

包膜细菌在生长过程中可能会褪去细胞膜。血清中孵育的CMCB在0.5小时和2小时的脱膜率分别是50%和93%(图6a)。在LB培养基中脱膜速率更快。在两种可抑制细菌分裂的培养条件(冷PBS,血清+SMX)下的实验(图6b,c),表明细胞分裂是脱膜的主要原因。CMCB的脱膜过程是可控,通过简单地切换培养基,可以很容易地将膜从CMCB中的去除时间控制在几小时到几天。这表明CMCB适用于按需释放或长期使用。


总之,可以很容易地用细胞膜挤压法来制备这些伪装细菌。该方法适用于不同菌株,适用于不同类型细胞膜的包衣。在天然细胞膜包裹的情况下,细菌表现出(1)低炎症反应,导致较少的副作用;(2)巨噬细胞清除率降低,导致血液储备增加;(3)在正常器官中的积累低。提高疾病部位的定植能力;(4)几乎不变的生物活性。鉴于这些独特的特点,作者推测该工具可广泛应用于诊断、生物成像和治疗应用中。


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