• 欢迎来到联科生物!
  • 证券代码: 831936
请登录|注册
  • 400-6721-600 400-6721-600
首页 > 生物资讯 > 技术资料 > 小鼠脾脏T细胞和人PBMCs 的体外T细胞活化

小鼠脾脏T细胞和人PBMCs 的体外T细胞活化

作者:联科生物    发布日期:2019-10-22 11:00


 

成熟T细胞通过TCR识别并与抗原-MHC复合物反应。TCR活化的最直接后果是信号通路的起始,这些信号通路包括诱导特异性蛋白酪氨酸激酶(PTKs)、PIP2分解、PKC活化以及细胞内钙离子浓度的升高。这些早期事件被传递到核,产生诸多效应:

•  1)   T 细胞克隆的扩增

•  2)   细胞表面活化标志的上调

•  3)   分化成效应性细胞

•  4)   诱导细胞毒或细胞因子的分泌

•  5)   诱导凋亡

最常用的体外刺激检测T细胞增殖的方法是用TCR的抗原或竞争性抗体活化T细胞。本方案是一个基本方法,用CD3体外刺激小鼠脾T细胞和人类外周血 T 细胞的增殖,关键参数包括细胞密度、抗体滴度和活化动力学。


一、小 鼠 T 细 胞 活 化

用包被的anti-CD3e(145-2C11) 单抗刺激小鼠T细胞;MTT法测细胞增殖。


实 验 材 料

•   1X无菌PBS

•   Anti-Mouse CD3ε, Functional Grade (Clone:145-2C11) (MultiSciences, Cat#AM003E)

•   Anti-Mouse CD28, Functional Grade (Clone:37.51)(MultiSciences, Cat#AM028)

•   RPMI-1640完全培养基

•   无菌的小鼠脾脏或淋巴结单细胞悬液

•   96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

•   刀豆蛋白A(ConA),可选 (Sigma, Cat#C5275)

•   MTT溶液(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

•   Formazan Solvent(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

•   红细胞裂解液(MultiSciences, Cat# LYS)


实 验 时 间

•    2 小时包被抗体

•   20 分钟制备脾脏单细胞悬液

•   20 分钟分析设置

•   2-4 天孵育


实 验 步 骤

1. 抗体包被至微孔板:

• 1)  用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3e(145-2C11)抗体溶液,计算所需的抗体量,每个条件或样本需做复孔。例如,包被半块板(48孔板)需要2.6ml抗体溶液。若用其他抗体共刺激时,CD3抗体的浓度可以降低。

• 2)  96孔板中,每孔加入50μl抗体,空白对照孔加50μl无菌PBS。

• 3)  用ParafilmTM 膜将板封好,37℃孵育2小时或4℃过夜。

• 4)  加细胞之前,将孔内的抗体溶液吸去。

• 5)  每孔用200μl无菌PBS洗后,弃去PBS。

• 6)  重复洗一次,去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞:

• 1)  取脾脏,无菌制备单细胞悬液,溶血去除红细胞。

• 2)  计数细胞并重悬RPMI-1640完全培养基中,浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml~105/ml的浓度。

• 3)  洗板结束后,每孔加200μl细胞悬液,置于潮湿的37°C, 5% CO2培养箱中。可选择加刺激对照:ConA 1-4µg/ml刺激后孵育。

• 4)  加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

• 5)  孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

• 6)  每孔加 20μl MTT溶液,再放回至培养箱中孵育 4 小时。

• 7)  每孔加 50μl Formazan Solvent,轻轻振荡并孵育过夜。

• 8)  第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

• 9)  计算平均值和标准方差,作图。


相 关 产 品

 
供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences Anti-Mouse CD3e Monoclonal Antibody, Functional Grade AM003E 20/50/100μg
MultiSciences Anti-Mouse CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade AM028 20/50/100μg
MultiSciences 红细胞裂解液(不含固定剂)(10×) LYS 100/250/500T
MultiSciences MTT细胞增殖检测试剂盒 MTT001 100T
Corning 96孔板,平底,带盖,TC表面,带盖,灭菌 3596 50包/箱


二、 人 T 细 胞 活 化

用包被的CD3 单抗刺激人外周血单个核细胞(PBMCs);MTT法检测细胞增殖。


实 验 材 料

•  1X无菌PBS

•  Anti-Human CD3, Functional Grade (Clone:OKT3)(Multiscience, Cat: AH003)

•  Anti-Human CD28, Functional Grade (Clone:CD28.2)(Multiscience, Cat: AH028)

•  RPMI-1640完全培养基

•  无菌的人PBMCs

•  96孔平底带盖微孔板 (Corning, Cat#3596)

•  MTT溶液(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)

•  Formazan Solvent(MultiSciences, Cat#MTT001, MTT细胞增殖检测试剂盒组分)


实 验 时 间

•  2-18 小时包被抗体

•  30 分钟制备人PBMCs

•  20 分钟分析设置

•  2-4 天孵育


实 验 步 骤

1. 抗体包被至微孔板:

•  1)  用无菌PBS制备5-10µg/ml的anti-CD3(OKT3)抗体溶液,计算所需的抗体量,每个条件或样品需做复孔。例如,包被半块板(48孔板)需要 2.6ml 抗体溶液。若用其他抗体共刺激时,CD3抗体的浓度可以降低。

•  2)  96孔板中,每孔加入50μl抗体,空白对照孔加50μl无菌PBS。

•  3)  用ParafilmTM 膜将板封好,37℃孵育2小时或 4℃过夜。

•  4)  加细胞之前,将孔内的抗体溶液吸去。

•  5)  每孔用200μl无菌PBS洗后,弃去PBS。

•  6)  重复洗一次,去除所有的未结合抗体。

2. 加细胞:

•  1)  制备 PBMCs 并重悬于RPMI 完全培养基中,浓度为106/ml。根据实验需要可选择2-3x106/ml~105/ml的浓度。

•  2)  洗板结束后,每孔加 100μl 细胞悬液,每个样本重复做3个孔。

•  3)  加入2-5ug/ml anti-CD28抗体溶液。

•  4)  37°C, CO2培养箱孵育 2-4 天。可根据具体的实验进行优化。

•  5)  每孔加 20μl MTT溶液,再放回至培养箱中孵育 4 小时。

•  6)  每孔加 50μl Formazan Solvent,轻轻振荡并孵育过夜。

•  7)  第二天分光度计测定OD570和参考波长OD690。

•  8)  计算平均值和标准方差,作图。


相 关 产 品

 
供应商 产品名称 货号 规格
MultiSciences Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody, Functional Grade AH003 20/50/100μg
MultiSciences Anti-Human CD28 Monoclonal Antibody, Functional Grade AH028 20/50/100μg
MultiSciences 人淋巴细胞分离液 LSM01 200ml
MultiSciences MTT细胞增殖检测试剂盒 MTT001 100T
Corning 96孔板,平底,带盖,TC表面,带盖,灭菌 3596 50包/箱
今日推荐
  • 1
  • 2
  • 3

总排行

垃圾分类来了,听说实验室里更麻烦
「最严垃圾分类」已问世近两月,据政府公告称,到 202...[详情]
小小细菌—超厉害的“伪装者”
顾客使用联科试剂又发高分论文了!小伙伴快来围观,...[详情]
『日常』之大师兄and小师妹
烈日炎炎似火烧,广大留校的大师兄们、小师妹们又双...[详情]
有料视频:细胞因子和蛋白溶解稀释方法
《PeproTech重组细胞因子和蛋白溶解稀释方法》超好看![详情]
聚焦抗体应用与开发 助力国产智造
伴随基础研究的蓬勃发展和技术创新的不断突破,生命...[详情]
敲黑板:和师兄师姐谈未来提到的高频词
联科生物试剂发表SCI论文超过1000篇↓↓↓最高性价比国...[详情]
IL-35与热门疾病研究,你会pick谁
白细胞介素35 (IL-35)是由调节性T细胞产生的细胞因子,...[详情]
PD-1抗体药物:免疫治疗领域的“当红明星”
新里程美家国际医疗中心指出:当人体免疫内环境出现...[详情]
联科生物Maxi ECL kit助创科研奇迹
北京时间5月11日,浙江万里学院葛楚天团队在 Science 杂...[详情]
  • 客服热线 客服热线
    400-6721-600
  • 客服QQ 客服QQ
    400 6721 600
  • 产品订购 产品订购
    order@liankebio.com
  • 售后服务 售后服务
    tech@liankebio.com
在线客服
在线客服
  • 服务热线400-6721-600
    工作时间
    8:30-17:30
二维码
地址:中国杭州市拱墅区祥茂路36号光彩科技园B座2-4楼